[发明专利]一种磷脂酰糖苷的制备方法及其应用

说明书

本发明属于活性物质筛选技术领域，具体涉及一种磷脂酰糖苷的制备方法及其应用。本发明通过磷脂酶D水解磷脂酰胆碱，同时与糖类底物作用，生成磷脂酰糖苷。实现了酶法合成磷脂酰糖苷，并证实了所得到的磷脂酰糖苷具有预防减轻阿尔兹海默病症的能力，能改善行为认知障碍。

技术领域：

本发明属于活性物质筛选技术领域，具体涉及一种磷脂酰糖苷的制备方法及其应用。

背景技术：

阿尔茨海默症(Alzheimer'sdisease,AD)是一种神经退行性疾病，是目前最常见和最具破坏性的痴呆症，被世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)认定为全世界公共卫生的首要问题之一，影响了全世界近5000万人。阿尔兹海默症患者的海马和皮质会发生萎缩，最重要的神经病理学标志是Tau蛋白的过度磷酸化以及神经原纤维缠结的过度积累和淀粉样蛋白β(Amyloidbeta,Aβ)形成的淀粉样斑块沉积。此外，主要发病特征还有突触与神经元的功能丧失，反应性神经胶质增生，氧化和炎症损害。令人遗憾的是，目前AD的药物治疗仍处于初期阶段，可提供症状缓解但不会减缓疾病进展，由于社会和医疗保健的高成本，高患病率和死亡率，同时又缺乏有效的治疗方式，阿尔茨海默症已经成为一个亟待迫切解决的问题。

磷脂酰葡糖苷(PtdGlc)是目前唯一发现的磷脂酰糖苷化合物，从胎儿啮齿动物的大脑中成功分离出的纯PtdGlc仅具有一种脂肪酸组合：即sn-1和sn-2链分别分别是硬脂酸(C18：0)和花生酸(C20：0)。PtdGlc也存在于人类嗜中性粒细胞中，其脂肪酸组成包含C18:0/C18:0和C18:0/C20:0。磷脂酰葡糖苷这种糖基化脂质，已经被发现在多种细胞过程中起着基本作用。磷脂酰葡糖苷已被证明与神经传导相关，特别是TrkA与TrkC相关的轴突调控。磷脂酰葡糖苷的代谢产物，溶血磷脂酰-β-d-葡萄糖苷(LysoPtdGlc)，一种亲水性甘油磷脂，也被证明了其在激活GPR55在脊髓感觉轴突的形态特异性排斥指导中的作用。虽然知道磷脂酰糖苷在脑中的重要性，但是目前仍没有研究摄入磷脂酰糖苷对神经退行性疾病的作用。同时，由于分离技术的限制，极其难以纯化得到高纯度的磷脂酰葡糖苷。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是目前仍没有研究摄入磷脂酰糖苷对神经退行性疾病的作用；同时，由于分离技术的限制，极其难以纯化得到高纯度的磷脂酰葡糖苷。

为解决上述问题，本发明利用磷脂酶D实现了酶法合成磷脂酰糖苷，并证实了所得到的磷脂酰糖苷具有预防减轻阿尔兹海默病症的能力，能改善行为认知障碍。

为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种磷脂酰糖苷的制备方法，通过磷脂酶D水解磷脂酰胆碱，同时与糖类底物作用，生成磷脂酰糖苷。

进一步的，所述磷脂酰胆碱在反应前与硅胶粉末充分混合，便于后续磷脂酰胆碱底物能够均匀分散于反应体系中。

进一步的，所述磷脂酶D和糖类底物在反应前混合溶于磷酸盐缓冲液中，提供酶反应需要的水环境。

进一步的，将混合硅胶粉末后的磷脂酰胆碱与磷脂酶D(10-40U/ml)和糖类底物的溶液(磷脂酰胆碱：糖类底物＝1:40-1:10mol/mol)混合，然后于35-45℃温度环境下充分搅拌12h后离心收集沉淀，在此期间，磷脂酶D可以催化水解磷脂酰胆碱中的胆碱基团，并与糖类底物进行脂交换反应，生成我们所需要的磷脂酰糖苷。温度和时间的改变或者糖类底物的不足会导致底物中磷脂酸等副产物的产生。

进一步的，将石油醚与乙醇溶液按照4:1(V/V)的比例混合后，加入反应后的沉淀，搅拌十分钟，静置分层后取走上层石油醚相，提取反应后的沉淀3次，每次加入等量的加入相同体积的石油醚，此时产物磷脂酰糖溶于上层石油醚相，而多余的胆碱与底物丝氨酸则呈絮状沉淀，而多余的底物磷脂酰胆碱则溶于乙醇层。

进一步的，合并石油醚相并去除后得到高纯度的磷脂酰糖苷。