[发明专利]一种阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物、制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物、制备方法及其应用，属生物医用高分子材料技术领域。阳离子化柞蚕丝素蛋白由经1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐活化的柞蚕丝素蛋白与聚乙烯亚胺偶联得到，表面带正电荷的柞蚕丝素蛋白依靠静电吸附作用涂层至腺病毒表面，获得阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物。本发明针对裸腺病毒载体的缺陷和现有腺病毒复合物载体的不足，构建了一种具有高感染效率、低细胞毒性和细胞靶向性的新型阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物基因载体，在针对其靶细胞的体内外感染中具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种基因传递载体材料、制备方法及其应用，属于生物医用高分子材料技术领域。

背景技术

肿瘤的基因治疗是指利用基因操作方法引入外源基因，纠正肿瘤细胞基因的结构或功能缺陷，或通过增强宿主对肿瘤的杀伤能力和机体的防御机能治疗肿瘤。基因治疗具有针对性强、毒副作用小、疗效好等优势，其关键在于构建安全、高效的基因传递载体。目的基因递送至肿瘤细胞的方式主要包括两种，依托病毒载体的介导和借助非病毒载体的转染。非病毒载体主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物。脂质体价格昂贵，易与血浆蛋白发生吸附作用导致质粒DNA解体，转染效率不稳定。阳离子聚合物可与DNA结合，形成尺寸较小的微粒复合物，但因缺乏疏水结构域，不能与内质膜直接作用来融合或破坏内质体的稳定性。非病毒载体转染目的基因的效率和基因表达水平远低于病毒载体，难以有效地发挥目的基因的抑癌作用，同时还存在细胞毒性、降解性差等问题。

病毒载体利用亲代病毒高度进化的机制，有效识别和感染细胞，进而获得稳定、高效的基因表达，适合基因治疗的应用和作为生物学研究的工具。腺病毒作为常用的基因传递载体，不仅能有效地将目的基因递送至肿瘤细胞中并高水平表达，也易于培养和纯化，还能够插入大片段的外源基因，携带的基因不会整合到受染细胞基因组，表达的基因序列稳定，没有致癌和致突变的危险。但腺病毒也存在免疫原性风险、高滴度时的细胞毒性、对柯萨奇-腺病毒受体阳性细胞的趋向性等不足。采用阳离子聚合物静电涂层腺病毒，能屏蔽腺病毒与宿主的相互作用，阻断腺病毒的固有受体介导的内吞作用。聚乙烯亚胺和聚赖氨酸是最早用于静电涂层腺病毒的阳离子聚合物，能增强肿瘤细胞对腺病毒的感染性，保护腺病毒免受血清抗体的中和，但存在核内体逃逸效率低、降解性差和细胞毒性问题，还存在进入血液后快速解离的障碍。因此，构建生物相容性好、可生物降解、感染效率高、免疫原性低的新型腺病毒基因载体在肿瘤基因治疗领域将具有广阔的应用前景。

在本发明之前，文献“Systemic image-guided liver cancer radiovirotherapyusing dendrimer-coated adenovirus encoding the sodium iodide symporter astheranostic gene”（J Nucl Med, 2013, 54: 1450-1457）中采用聚酰胺-胺型树状高分子涂层腺病毒载体，能够明显增强细胞对载体的摄取并阻断腺病毒对柯萨奇-腺病毒受体阳性细胞的趋向性。但是聚酰胺-胺型树状高分子的降解性差，影响载体中目的基因在靶细胞中的表达。

发明内容

本发明针对裸腺病毒载体的缺陷和现有腺病毒复合物载体的不足，提供一种能高效率递送外源性目的基因、低细胞毒性的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物、制备方法及其应用。

本发明采用以下技术方案实现发明目的：提供一种阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物，阳离子化柞蚕丝素蛋白以静电吸附作用涂层至腺病毒表面；所述复合物的粒径为315～448 nm，复合物的表面Zeta电位为-7.2～-0.1 mV。

本发明技术方案还包括一种如上所述的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的制备方法，将柞蚕丝脱胶、溶解、透析后得到再生柞蚕丝素蛋白溶液，再进行如下步骤的加工：