[发明专利]一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：P1‑F：5’‑GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAAC TCGCTTCAGGTTCAG‑3’；P1‑R：3’‑TTGTGAGCGGA TAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG‑5’；引物所扩增的目的片段长度为477bp；PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：Probe：5'‑FAM‑CCGTCTACACCCGGGCGCC‑TAMRA‑3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。该用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法灵敏度高，对于低浓度的克雷伯菌样品也能够准确检测出来，使用高特异性的引物和Taqman探针，保证准确的检出融合基因且假阳性低，全程监控。

技术领域

本发明属于克雷伯菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Kpn)属于革兰氏阴性杆菌，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一，为呼吸道感染的重要病原体，对人的致病性较强，常引起重症肺炎，多发于住院的衰弱患者；当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或者小叶融合性实变，以上叶较为多见，病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。

传统的细菌检验方法主要通过涂片镜检和分离培养的方法对细菌生理化特征进行分类。涂片镜检的方法需要有丰富经验的技术工作者根据细菌形态、排列方式和染色性作出初步诊断，分离培养需要较长的时间才能进行结果判读，不利于及时诊断病原。患者有病情恶化蔓延的风险。荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、稳定性好、无污染、实时和准确等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。而传统的肺炎克雷伯氏菌检测方法具有检出率低、准确性低缺点。所以我们需要一款新型的用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法来解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：

P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；

P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；

引物所扩增的目的片段长度为477bp；

PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：

Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

优选的，所述PCR反应液包括缓冲液、140-160μM dNTP 100μL、13-15μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl₂溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶。

优选的，PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA 5μL。

优选的，PCR反应循环参数为：