[发明专利]一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法

权利要求书

1.一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：

P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；

P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；

引物所扩增的目的片段长度为477bp；

PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：

Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液包括缓冲液、140-160μM dNTP 100μL、13-15μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl₂溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA5μL。

4.根据权利要求1所述的一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法，其特征在于：PCR反应循环参数为：

先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。

5.根据权利要求1所述的一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法，其特征在于：所述阴性对照品为去核酸水。

6.根据权利要求1所述的一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法，其特征在于：所述阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板。

7.一种根据权利要求1所述的用于检测肺炎克雷伯菌方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：

步骤一：样本细胞培养，培养条件为37℃、5％CO₂；

步骤二：样本细胞核算提取，取待测样本2μL，加入相应5倍体积的DNA提取液，均匀混合后置于水浴锅中，以5℃/min的速率进行升温，达到60℃停止升温且放置30min，取出后震荡10min，然后再放入60℃的水浴锅中10min，取出后加入等体积的异丙醇，室温放置2min，12000rpm离心5min后弃上清，加入20μL无菌水溶解制得所述样品DNA，备用；

步骤三：逆转录，使用Promega GoScript^TM Reverse Transcriptase试剂盒，按照试剂盒说明书操作来获得cDNA；

步骤四：按照25μL体系来配置PCR检测液，分别获得阳性对照品、样本以及阴性对照品；

步骤五：荧光PCR检测，将阳性对照品、样本和阴性对照品放入PCR仪中进行检测，查看检测结果。