[发明专利]新型冠状病毒qRT-PCR一步法试剂盒反应液及其试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种新型冠状病毒qRT‑PCR一步法试剂盒反应液及其试剂盒和方法，包括包括：PT‑PCR反应液、酶混合液、Solution、特异性引物及探针，且Solution的配方为：(NH₄)₂SO₄ 20～40mM、吐温20 1.8E^‑6～3.6E^‑6、三氮化钠4.5E^‑2～9E^‑2、甘油0.05～0.1mM、二甲基亚砜0.07～0.14mM、牛血清蛋白1.5E^‑7～3E^‑7；包括含有已知ORF1ab基因或N基因、Solution配方的试剂盒；包括试剂盒的检测方法。本发明可有效降低已知基于ORF1ab基因或N基因靶标的qRT‑PCR检测技术对2019‑nCoV新型冠状病毒检测出现假阴性的情况，从而提高试剂盒诊断准确性，降低减少传染隐患、安全风险以及资源消耗。

技术领域

本发明涉及生物技术应用领域，具体是涉及一种新型冠状病毒qRT-PCR一步法试剂盒反应液及其试剂盒和方法。

背景技术

新型冠状病毒在临床实践过程中，一些弱症状、病毒载量低的初诊患者样本、样本中抑制物高的患者样本、治疗后待复核出院的患者样本等，不能被明确诊断，造成了极大的传染隐患、安全风险以及资源消耗。

因此，在使用已知的qRT-PCR技术检测和定量分析样品使用ORF1ab基因或N基因进行检测，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，如何基于已知的靶多核苷酸序列设计出检测更为灵敏的试剂盒成为了一个关键性的基本技术环节。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种新型冠状病毒qRT-PCR一步法试剂盒反应液及其试剂盒和方法，以通过增强提高试剂盒的反应体系从而减少和避免检测结果的假阴性或假阳性。

本发明的技术方案是：一种新型冠状病毒qRT-PCR一步法试剂盒反应液，包括：PT-PCR反应液、酶混合液、Solution、特异性引物及探针；所述PT- PCR反应液由每反应份计包括：DTT 5～40mM、KCl 100～200mM、MgSO₄ 3～6mM、Tris-HCl 20～40mM；所述酶混合液由每反应份计包括：热启动Taq酶 5-8mM、MMLV逆转录酶3-4mM、RNA抑制剂10-15mM，dNTP 10mM，并通过酶保存液补足至4uL；所述Solution的配方由每反应份计为：(NH₄)₂SO₄ 20～40mM、吐温20 1.8E^-6～3.6E^-6、三氮化钠4.5E^-2～9E^-2、甘油0.05～0.1mM、二甲基亚砜0.07～0.14mM、牛血清蛋白1.5E^-7～3E^-7。

更进一步地，所述Solution配方还包括增强剂2.5％体积比，所述增强剂的制备方法为：将10mM Tris-HCl与1～1.5mM三辛基氧化磷、0.5～0.7mM邻二氮菲、0.05～0.2mM甲酰胺混合，摇匀，得到增强剂。

本发明还公开了一种基于新型冠状病毒qRT-PCR一步法试剂盒反应液的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2的试剂盒反应液。

进一步地，所述试剂盒内的反应体系具体成分以每人份计包含：0.8uL RT- PCR反应液、4uL酶混合液、2.0uL 10×Solution、0.25uL正向引物、0.25uL 反向引物、0.2uL探针，0.4uL 2019-nCoV新型冠状病毒模板，无菌水补足至 20uL；其中，所述正向引物、反向引物及探针的含量为所对应的2019-nCoV新型冠状病毒基因、内参基因RPP30的引物及探针各半。

更进一步地，所述2019-nCoV新型冠状病毒基因、内参基因RPP30的引物及探针的序列分别为：