[发明专利]检测低突变丰度样本的NGS文库制备接头及其制备方法

说明书

本发明提供了一种检测低突变丰度样本的NGS文库制备接头及其制备方法，涉及基因工程技术领域，接头含有P5及P7引物序列，还包括a.测序引物位点SP序列；b.UMIs序列；c.样本标签Index序列。P5端的3’端依次连接测序引物位点SP序列、连接在一起的UMIs序列和样本标签Index序列，P7端的5’端依次连接测序引物位点SP序列、连接在一起的UMIs序列和样本标签Index序列。接头序列使用了独特设计的样本标签及UMIs序列位置，使其特别适用但不限于插入片段大小为100‑250bp的样本文库的构建，此外，双端UMIs大大提高了其对假阳性突变的识别能力，因而更加适用于低突变丰度样本的检测。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种检测低突变丰度样本的NGS文库制备接头及其制备方法。

背景技术

下一代测序(NGS)可以同时对数百万个DNA片段进行测序。为了实现高通量并行测序，待测目标DNA的两端必须带有特定的NGS接头。NGS接头的基本结构包含P5，P7引物序列和测序引物结合序列，这些组件在非对称Y形接头中必须按照精心设计的顺序排列。除此以外，高级NGS接头可能包含其他序列，例如样本标签标签序列(Index)和单一分子标识序列(UMIs)，不同的接头设计中，这些序列可位于接头的不同位置，数量也不尽相同。NGS接头的基本结构是两条形成Y形链的不对称结构，这意味着两条链(P5和P7寡核苷酸)序列的一部分可以互补形成双链，而寡核苷酸链的其他部分根据每条链的不同功能带有不相互补的序列。在接头的基本结构上，为满足不同的功能，开发出了不同类型的接头。针对不同的目的，NGS接头具有不同的设计方式，但现有的NGS接头并没有特别适用于插入片段大小为100-250bp的样本(如cfDNA)文库的构建，并且假阳性突变识别能力低，不适用于低突变丰度样本的检测。

发明内容

为解决现有的NGS接头并没有特别适用于插入片段大小为100-250bp的样本(如cfDNA)文库的构建，并且假阳性突变识别能力低，不适用于低突变丰度样本的检测等问题，本发明提供了一种新的特别适用于插入片段大小为100-250bp的样本(如cfDNA)文库的构建的检测低突变丰度样本的NGS文库制备接头及其制备方法。

首先，本发明提供一种检测低突变丰度样本的NGS文库制备接头，包括P5端寡核苷酸链和P7端寡核苷酸链，寡核苷酸链上含有P5及P7引物序列，还包括a.测序引物位点SP序列；b.UMIs序列；c.样本标签Index序列；其中，P5端寡核苷酸链包括P5引物序列，其3’端依次连接测序引物位点SP序列、连接在一起的UMIs序列和样本标签Index序列，P7端寡核苷酸链包括P7引物序列，其5’端依次连接测序引物位点SP序列、连接在一起的UMIs序列和样本标签Index序列；P5与P7端寡核苷酸链除P5及P7引物序列外，其他部分序列反向互补；所述NGS文库制备接头呈Y型结构，P5及P7引物序列为分别为Y型上方的两头。

上述P5/P7引物序列，使接头适用于Illumina测序平台，测序引物位点SP序列使接头可进行Illumina平台双端测序，UMIs序列使接头更适用于低突变丰度样本测序。

上述UMIs序列可以为一段1-16碱基的随机寡核苷酸。

上述样本标签Index序列可以为一段1-16碱基寡核苷酸。

优选地，上述UMIs序列及样本标签Index序列位于SP序列与插入片段之间，UMIs序列和样本标签Index序列位置可互换。此结构使接头特别适用于插入片段大小为100-250bp样本建库。

优选地，上述接头可以含3’T粘性末端，便于与插入片段连接。

优选地，上述接头正链及负链5‘端可含磷酸化基团。

基于上述技术方案，优选地，本发明提供的NGS文库制备接头正链与负链碱基序列可以为：