[发明专利]一种检测CAR-T基因拷贝数的标准物质的制备

说明书

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种检测CAR‑T基因拷贝数的标准物质的制备。本发明提供了一种293细胞系，通过将TCR的CD3ζ链，GFP和WPRE的DNA序列插入到293细胞的AAVS1位点形成的。本发明提供的293细胞系，可以用于检测筛选的细胞基因组DNA是否可以作为单拷贝的标准品，可以用于滴定慢病毒，估算CAR‑T细胞感染效率。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种检测CAR-T基因拷贝数的标准物质的制备。

背景技术

293细胞是人肾上皮细胞系，有多种衍生株，比如HEK293，293T/17等，来源都是人胚胎肾细胞，其极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CART)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CART细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CART细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。

慢病毒是CAR-T细胞工程的主要传递载体。然而，由于缺少慢病毒滴定的标准，因此比较不同试验的疗效结果比较困难。至今，最准确的确定慢病毒滴定的方法是使用qPCR来估计前病毒拷贝的数量，该前病毒已经整合到滴定细胞的基因组中。为了在同一实验室中获得来自不同实验室甚至不同批次病毒的可比较的滴定结果，确定一个病毒滴定标准是必要的。这种标准最好是来自克隆细胞系的基因组DNA，仅包括qPCR靶基因的一个整合拷贝。

中国专利申请CN108559792A公开了一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR引物、试剂盒及方法，所述引物落在慢病毒的包膜上，不需要荧光标签即可对滴度进行检测。但是，这种方法只能对单一病毒拷贝进行检验，无法检验不同试验样品的疗效结果。

综上可知，现有技术中普遍存在由于缺少慢病毒滴定标准，使得比较不同试验的疗效结果比较困难的问题。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点，本发明提供了一种检测CAR-T基因拷贝数的标准物质的制备。本发明提供了一种293细胞系，可以用于估算CAR-T细胞的感染效率，计算CAR-T细胞中CAR-T基因插入的拷贝数，且计算结果精确。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种293细胞系，包含TCR的CD3ζ链，GFP和WPRE的DNA序列；其中，所述TCR的CD3ζ链序列信息如SEQ ID NO.1所示，所述GFP的序列信息如SEQ ID NO.2所示，所述WPRE的序列信息如SEQ ID NO.3所示。

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO.1)；