[发明专利]一种检测CAR-T基因拷贝数的标准物质的制备

权利要求书

1.一种293细胞系，其特征在于，包含TCR的CD3ζ链，GFP和WPRE的DNA序列；其中，所述TCR的CD3ζ链序列信息如SEQ ID NO.1所示，所述GFP的序列信息如SEQ ID NO.2所示，所述WPRE的序列信息如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的293细胞系，其特征在于，将所述TCR的CD3ζ链，GFP和WPRE的DNA序列插入到293细胞的AAVS1位点。

3.如权利要求1或2所述的293细胞系，其特征在于，编码所述TCR的CD3ζ链的引物1，包括上游引物及下游引物，所述上游引物的序列信息如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物的序列信息如SEQ ID NO.5所示。

4.如权利要求1或2所述的293细胞系，其特征在于，编码所述WPRE的DNA序列的引物2，包括上游引物及下游引物，所述上游引物的序列信息如SEQ ID NO.6所示，所述下游引物的序列信息如SEQ ID NO.7所示。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的293细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)利用如SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5所示的引物合成TCR的CD3ζ链，SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.7所示的引物合成WPRE的DNA序列，得TCR的CD3ζ链及WPRE的DNA序列；

(2)利用spCas9-gRNA使293细胞的双链DNA在AAVS1位点断裂，将步骤S1所得TCR的CD3ζ链及WPRE的DNA序列、GFP序列插入到AAVS1位点，即得。

6.一种利用权利要求1-5任一项所述的293细胞系估算CAR-T病毒拷贝数的方法，其特征在于，操作步骤如下：

S1、将所述293细胞系导入CAR-T细胞中，得转染后的CAR-T细胞；

S2、利用PCR技术筛选转染成功的CAR-T细胞，得成功转染的CAR-T细胞；

S3、利用PCR技术及NGS技术相结合，鉴定具有单个插入的克隆。

7.如权利要求6所述的利用293细胞系估算CAR-T病毒拷贝数的方法，其特征在于，所述步骤S2中的PCR技术的具体操作为：配制10μL的PCR体系，引物1的上、下游引物各1μL，10×master mix 5μL，DNA 1μL，水2μL；PCR扩增程序为，95℃，预热5min；95℃，加热30s，58℃，退火30s，72℃，延伸1min，36个循环；72℃，延伸10min；引物2的PCR技术与引物1类似。

8.如权利要求6所述的利用293细胞系估算CAR-T病毒拷贝数的方法，其特征在于，所述步骤S3中的PCR技术与步骤S2类似，所述步骤S2中的NGS技术是将PCR产物进行测序，筛选具有单个克隆的CAR-T细胞。

9.一种如权利要求1-4任一项所述的293细胞系在滴定慢病毒、估算CAR-T细胞感染效率和计算CAR-T细胞中CAR-T基因插入拷贝数中的作用。