[发明专利]一种诊断用对羟基苯甲酸羟化酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种诊断用对羟基苯甲酸羟化酶及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域。所述的对羟基苯甲酸羟化酶基因及其氨基酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其可以从施氏假单胞菌中克隆表达获得，并且可以用于人血清/血浆中胆碱酯酶含量的检测。本发明制备的对羟基苯甲酸羟化酶具有纯度高、活性好、产量高、成本低等优点，易于推广应用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新的对羟基苯甲酸羟化酶及其制备方法和在体外诊断试剂中的应用。

背景技术

胆碱酯酶(Cholin esterase，CHE)是一类催化酰基胆碱水解的酶类，以多种同功酶形式存在于血清或血浆中的一种水解酶。人体内存在两种胆碱酯酶，一种是乙酰胆碱酯酶，又称“真性胆碱酯酶”或“特异性胆碱酯酶”主要作用于乙酰胆碱，存在于红细胞及中枢神经系统的灰质中；另一种为血清胆碱酯酶，特异性较差，除可用于乙酰胆碱外，还能作用于其他胆碱酯类，故又称“假性胆碱酯酶”或“非特异性胆碱酯酶”，此酶主要由肝脏产生，如果肝细胞变性、坏死越严重，血清胆碱酯酶合成就越少，临床常规检查的胆碱酯酶是“假性胆碱酯酶”。

胆碱酯酶的临床意义：增高见于神经系统疾病、甲状腺功能亢进、糖尿病、高血压、支气管哮喘、Ⅳ型高脂蛋白血症、肾功能衰竭等；减低见于有机磷中毒、肝炎、肝硬化、营养不良、恶性贫血、急性感染、心肌梗死、肺梗死、肌肉损伤、慢性肾炎、皮炎及妊娠晚期等，以及摄入雌激素、皮质醇、奎宁、吗啡、可待因、可可碱、氨茶碱、巴比妥等药物。

胆碱酯酶是衡量肝脏功能的一个重要指标。在临床中，测定血清胆碱酯酶活性是协助诊断有机磷中毒和评估肝实质细胞损害的重要手段。脂肪肝患者除有三酰甘油明显增高及胆固醇和Apo-B明显升高外，血清胆碱酯酶也明显升高，有推断：高脂血症时脂肪酸合成和转换增加，导致肝中酰基CoA积累，继而产生酰基胆碱等，因此胆碱酯酶活性升高可能系过多底物诱导肝合成酶增加的结果，脂肪肝患者胆碱酯酶平均水平较正常对照组比较显著升高，是脂肪肝患者又一突出的生化指标。此外，血清胆碱酯酶活性增高还主要见于肾脏疾病、肥胖、脂肪肝、甲状腺功能亢进症等，也可见于精神分裂症、溶血性贫血、巨幼细胞性贫血等。

对羟基苯甲酸羟化酶(p-hydroxybenzoate hydroxylase，PHBH)是含有大约400个氨基酸残基的保守蛋白质。它的主要活性是催化对羟基苯甲酸的羟基化生成原儿茶酸(3,4-二羟基苯甲酸)。对羟基苯甲酸羟化酶属于黄素单加氧酶(Flavin monooxygenases，FMO)，存在于原核生物和真核生物如人体肝脏中。其对芳香化合物进行羟基化反应时能把第二个羟基加到第一个羟基的邻位上，促进芳香化合物的后续断裂。在此催化反应过程中，黄素组分发生了变化，先被NAD(P)H还原，被还原的黄素再和O₂反应生成氧化物R-(FAD)-O-OH。对羟基苯甲酸羟化酶在3,4-二羟基苯甲酸加氧酶的参与下，用于对血清或血浆中的胆碱酯酶的酶活进行测定。其反应的原理是：

反应中NADPH的减少是通过340nm波长下分光光度法来进行检测的。

对羟基苯甲酸羟化酶的基因在多种微生物中被测序，并研究其晶体结构和酶功能，比如在假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、红球菌属(Rhodococcus)和贪铜菌属(Cupriavidus)中均发现了对羟基苯甲酸羟化酶，但是迄今为止没有在施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中发现对羟基苯甲酸羟化酶的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对羟基苯甲酸羟化酶和编码该蛋白的基因PHBH，以及从施氏假单胞菌中生产该酶制品的方法。

本发明的技术方案如下：

一种诊断用对羟基苯甲酸羟化酶，其基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。