[发明专利]一种中性普鲁兰酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种中性普鲁兰酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明分别通过对普鲁兰酶的第138位、第691位、第692位和第694位的氨基酸进行突变，得到了四个热稳定性提高且催化效率未改变的普鲁兰酶突变体D138F、C691R、G692M及T694F。在70℃下，其半衰期可分别是野生型的1.35、1.58、2.07及1.64倍。其中，G692M突变体的热稳定性得到最明显的改善，其在60、65℃下的半衰期甚至可分别达到58h、19h，分别是野生型的2.5、1.8倍。本发明中热稳定性提高的中性普鲁兰酶突变体将更适合于工业应用。

技术领域

本发明涉及一种中性普鲁兰酶突变体及其应用，属于酶工程及基因工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)是一类催化支链淀粉、普鲁兰多糖及相关聚合物的α-1,6-糖苷键水解的淀粉脱支酶，目前主要应用于淀粉的糖化。淀粉结构复杂，分为直链淀粉和支链淀粉，且75％-80％是支链淀粉，其解聚成低聚糖或小分子葡萄糖需要多种酶的协同作用。在淀粉糖化过程中，糖化酶或β淀粉酶主要作用于α-1,4-糖苷键，对α-1,6-糖苷键作用非常有限，而β淀粉酶遇到α分支点则停止作用，这使得该法淀粉制糖的最高产率(DE值)被限制在60％左右。所幸的是，在糖化液中加入解支酶能够在一定程度上减轻这一限制所带来的损失，解支酶是指能够水解α-1,6-糖苷键的酶，包括普鲁兰酶、寡-1,6-葡萄糖苷酶、异淀粉酶、R-酶。不同的解支酶的性质也不尽相同，比如，寡-1,6-葡萄糖苷酶只能水解经过其他酶修饰过的底物中的α-1,6-糖苷键，而普鲁兰酶和异淀粉酶能够水解未经修饰的底物，而异淀粉酶更倾向于水解高分子量的底物，普鲁兰酶却能水解的最小底物只需两条由α-1,6-糖苷键连接的含有两个由α-1,4-糖苷键连接的葡萄糖链段，因而普鲁兰酶能更大程度地利用底物，其与糖化酶或β-淀粉酶协同作用，从而使得淀粉能够得到充分糖化。

尽管普鲁兰酶具有巨大的应用前景，但目前报道并已应用工业化生产的普鲁兰酶仍然存在如下2个主要缺陷：

第一，目前已应用于工业化生产的普鲁兰酶菌株主要为丹麦诺维信公司Bacillusacidopullulyticus和美国Genencor公司的Bacillus deramificans，其所产普鲁兰酶为酸性普鲁兰酶。酸性普鲁兰酶应用于淀粉水解时，由于其最适pH在4.5-5.5左右的偏酸范围，而液化反应后的原始pH在6.0-6.5的偏中性的范围，故在液化与糖化的过渡中需要先对液化液的pH调节至酸性范围后再加入普鲁兰酶进行糖化，这不可避免地增加了资源的消耗和水解时间；

第二，目前大多数报道中的普鲁兰酶大多是中温酶(40-60℃)，而一般糖化温度60-70℃，仅只有少数的嗜热酶能够在一般糖化温度下有较好的活性，并且在这少数的嗜热普鲁兰酶中，其酶学性质尤其是其热稳定性与工业应用不相符。

因而寻找既能在偏中性条件下反应、又具有良好的热稳定性的普鲁兰酶成为一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种耐高温的中性普鲁兰酶突变体，所述普鲁兰酶突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶为亲本酶，将亲本酶的第138位、691位、第692位、第694位任一位点的氨基酸发生突变，得到普鲁兰酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本酶，将亲本酶第138位的天冬氨酸突变为苯丙氨酸，并命名为D138F。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体D138F的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本酶，将亲本酶第691位的半胱氨酸突变为精氨酸，并命名为C691R。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体C691R的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。