[发明专利]表达SARS-CoV-2纤突蛋白（S）或其变异体的重组VSV病毒及其构建和应用

说明书

本发明提供一种表达SARS‑CoV‑2纤突蛋白(S)或其变异体的重组VSV病毒及其构建和应用，重组VSV病毒构建包括以下任一方法：通过SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变异体S_ΔCT蛋白构建假型化VSV病毒；采用M三位点突变的VSV病毒、采用M和G蛋白突变的VSV病毒或采用以结构蛋白顺序重排的VSV病毒为载体，构建表达SARS‑CoV‑2的S蛋白或其变异体S_ΔCT的重组VSV病毒。其构建的重组VSV病毒是针对SARS‑CoV‑2病毒的S蛋白进行，因此不涉及其活病毒，将不会产生生物安全问题。构建的重组VSV病毒可用于疫苗的研制以及人、动物体内SARS‑CoV‑2病毒特异性中和抗体的检测。

技术领域

本发明涉及新型冠状病毒研究技术领域，具体地说，涉及一种表达SARS-CoV-2的纤突蛋白(S)或其变异体的重组水泡性口炎病毒(VSV)及其构建和应用。

背景技术

SARS-CoV-2(以下简称CoV-2)是已知的第7个人冠状病毒。根据血清型和基因组特点，冠状病毒科被分为α、β、γ和δ四个属。CoV-2属于β冠状病毒属，该属冠状病毒 还包括中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)和严重呼吸综合征相关冠状病毒 (SARS-CoV),对CoV-2全长基因组进行的系统进化分析表明，该新型冠状病毒与SARS 病毒的相似度高于MERS病毒。

CoV-2基因组为单股正链RNA，长度约为29.8Kb，其5’端为编码复制酶复合物的 开放阅读框(Open reading frame，ORF)1ab，占基因组全长约2/3，编码聚合酶等非结 构蛋白；后1/3区域编码纤突蛋白(Spike,S)、小囊膜蛋白(Envelope,E)、膜蛋白 (Membrane,M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)。纤突蛋白(S)以三聚体的形式嵌 入病毒粒子囊膜的表面，负责病毒与宿主细胞表面受体结合，是冠状病毒最重要的中和 保护性抗原，也是疫苗研制的最主要靶抗原。最新的研究表明，CoV-2的受体与 SARS-CoV相同，均为血管紧张素转换酶2(ACE2)，然而，冠状病毒S蛋白氨基酸序列 分析也显示，SARS病毒S蛋白与ACE2互作的5个关键氨基酸位点，在CoV-2中有4 个发生了改变。这提示病毒的二者间免疫原性可能发生了显著变化。

防范病毒感染最有效的方法是使用疫苗，但目前仍缺乏控制人冠状病毒感染的有效 疫苗和成熟技术。冠状病毒具有高度的变异性，这一方面是由于该类病毒属于RNA病毒，其RNA复制酶纠错能力低，易导致基因突变，另一方面，冠状病毒毒株之间可发 生基因重组，更增加了疫苗研制的难度。因此，如能构建一个快速研制疫苗的通用技术 平台，将有助于应对突发疫情。目前常用的研制疫苗方法包括灭活疫苗和减毒疫苗，灭 活疫苗的制备需对病毒进行大量培养，并经灭活后使用，这种方法对高致病性病毒如 SARS等的生产安全要求极高，需在生物安全3级实验室进行。病毒大规模培养，一旦 泄漏将产生巨大灾难；此外，灭活疫苗须多次接种，产生效力所需时间长，且无法有效 激发粘膜免疫。人新型冠状病毒(CoV-2)虽然已经VeroE6细胞体外分离培养成功，但病 毒高水平生产仍需对培养条件进行充分优化，包括合适的细胞系等。减毒活疫苗病毒株 的获取方法有传统细胞传代法和通过基因工程技术使病毒毒力基因缺失，但失去致病力 的减毒活疫苗有可能逆转为致病株，冠状病毒在野外易发生重组，减毒突变株在自然条 件下可与野毒株重组重新获得毒性，这些缺点使得难以在短时间内获得传统意义上的人 新型冠状病毒疫苗，需寻找新的研制方法。这其中，借助安全和技术成熟的病毒载体来 高效表达CoV-2关键保护性抗原可能是一种有效的解决途径。目前，常用的病毒载体包 括：DNA病毒载体(如腺病毒、痘病毒)；反转录病毒载体(如慢病毒)以及RNA病 毒载体(如水泡性口炎病毒和麻疹病毒)等。