[发明专利]表达SARS-CoV-2纤突蛋白（S）或其变异体的重组VSV病毒及其构建和应用

权利要求书

1.一种表达人新型冠状病毒SARS-CoV-2纤突蛋白S的重组水泡性口炎病毒VSV的构建方法，其特征在于，包括以下方法中的任意一种：

A、通过SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体S_ΔCT蛋白构建假型化VSV病毒；

B、采用M三位点突变的VSV病毒为载体，构建表达SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体S_ΔCT的重组VSV病毒；

C、采用M和G蛋白突变的VSV病毒为载体，构建表达SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体S_ΔCT的重组VSV病毒；

D、采用以结构蛋白顺序重排的重组VSV病毒为载体，构建表达SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体S_ΔCT的重组VSV病毒。

2.根据权利要求1所述的表达人新型冠状病毒SARS-CoV-2纤突蛋白S的重组水泡性口炎病毒VSV的构建方法，其特征在于，方法A的具体步骤如下：

A1、重组质粒构建：

a11、对SARS-CoV-2病毒S基因进行碱基敲除，获得S蛋白突变体S_ΔCT；

a12、构建克隆VSV Indiana株全长基因组序列的质粒pVSV_IND；

a13、将S或S_ΔCT基因进行高保真PCR扩增，其5’和3’末端分别含有MluI和XhoI酶切位点，经双酶切后克隆到pVSV_IND质粒中，使S或S_ΔCT基因替换掉VSV中的G基因，分别得重组质粒pVSV_ΔG-S或pVSV_ΔG-S_ΔCT；

A2、病毒制备：

a21、用痘病毒vTF 7-3感染BHK21细胞，感染浓度为MOI＝5，1小时后去除痘病毒；

a22、将重组质粒pVSV_ΔG-S或pVSV_ΔG-S_ΔCT分别与辅助质粒pBS-G、pBS-N、pBS-P、pBS-L混合制备质粒转染混合液；

a23、将质粒转染混合液共转染步骤a21的BHK21细胞；

a24、用表达VSV G蛋白的质粒pVSV-G转染新鲜BHK21细胞，得BHK-G细胞；

a25、收集步骤a23获得的细胞上清，滤去vTF 7-3病毒，所得滤液加入到BHK-G细胞中进行扩增，2-3天后收集出现病变的细胞上清；

a26、将步骤a25收集的细胞上清经空斑纯化后，后续用VeroE6细胞扩增、鉴定，得假型化VSV病毒。

3.根据权利要求1所述的表达人新型冠状病毒SARS-CoV-2纤突蛋白S的重组水泡性口炎病毒VSV的构建方法，其特征在于，方法B或C的具体步骤如下：

B1、重组质粒构建：

b11、对SARS-CoV-2病毒S基因进行基因敲除，获得S蛋白突变体S_ΔCT；

b12、构建pVSV_MT质粒或pVSV_MT-G_Δ28质粒；

b13、将S或S_ΔCT基因进行高保真PCR扩增，其5’和3’末端分别含有XhoI和NheI酶切位点，经双酶切后克隆到pVSV_MT质粒中，使S或S_ΔCT基因替换掉VSV_MT中的G基因，得重组质粒pVSV_MT-S或pVSV_MT-S_ΔCT；或者将S或S_ΔCT基因进行高保真PCR扩增，其5’和3’末端分别含有XhoI和NheI酶切位点，经双酶切后克隆到VSV_MT-G_Δ28质粒中，使S或S_ΔCT基因插入到G_Δ28基因之后，分别获得重组质粒pVSV_MT-G_Δ28-S或pVSV_MT-G_Δ28-S_ΔCT；

B2、病毒制备：

与权利要求2中所述的步骤A2相同。