[发明专利]一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统及方法

权利要求书

1.一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统，其特征在于由三个探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR组成；

其中，所述的探针质粒pTK以SEQ ID NO.4所示的质粒pK为骨架质粒，将探针单元1克隆到骨架质粒中，所述的探针单元1在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS1，并用诱导型启动子诱导基因表达；所述的探针质粒pTK的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的探针质粒pTK-dR以所述的质粒pK为骨架质粒，将探针单元2克隆到骨架质粒中，所述的探针单元2在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS2，并用诱导型启动子诱导基因表达；所述的待测终止子位点TTS2是在所述的待测终止子位点TTS1两侧各加一段SEQID NO.5所示的RNA水解酶识别位点序列；所述的探针质粒pTK-dR的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

所述的探针质粒pTK-sR以所述的质粒pK为骨架质粒，将探针单元3克隆到骨架质粒中，所述的探针单元3在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS3，并用诱导型启动子诱导基因表达；所述的待测终止子位点TTS3，是去除所述的待测终止子位点TTS2上游5＇端的RNA水解酶识别位点的序列；所述的探针质粒pTK-sR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统中各质粒的构建方法，其特征在于：

所述的探针质粒pTK的构建方法包括以下步骤：

(1)直接化学合成基因片段tac、gfp1和rfp1，其中tac的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，gfp1的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，rfp1的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

(2)以片段tac和gfp1为模板，用引物tac-F/gfp-R1进行重叠PCR，得到片段tac-gfp1，再以片段tac-gfp1和rfp1为模板，用引物tac-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段tac-gfp-TTS1-rfp；其中所述的tac-F序列如SEQ ID NO.6所示，gfp-R1序列如SEQ ID NO.7所示，rfp-R序列如SEQ ID NO.8所示；

(3)用引物K-F/K-R将骨架质粒pK线性化，再将片段tac-gfp1-TTS1-rfp1通过一步克隆法插入线性载体中，得到终止子探针质粒pTK；K-F序列如SEQ ID NO.9所示，K-R序列如SEQID NO.10所示；

所述的探针质粒pTK-dR的构建方法包括以下步骤：

(i)直接化学合成得到片段tac、gfp2和rfp2；合成待测终止子位点TTS2的两条互补单链DNA序列，分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，退火后用引物DR-F/DR-R扩增片段TTS2；其中，tac的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，gfp2的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，rfp2的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，引物DR-F序列如SEQ ID NO.13所示，DR-R序列如SEQ ID NO.14所示；

(ii)以片段tac和gfp2为模板，用引物tac-F/gfp-R2进行重叠PCR，得到片段tac-gfp2；以片段TTS2和rfp2为模板，用引物DR-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段TTS2-rfp2；以片段tac-gfp2和TTS2-rfp2为模板，用引物tac-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段tac-gfp2-TTS2-rfp2；gfp-R2序列如SEQ ID NO.15所示；

(iii)用引物K-F/K-R将骨架质粒pK线性化，再将片段tac-gfp2-TTS2-rfp2通过一步克隆法插入线性载体中，得到终止子探针质粒pTK-dR；

所述的探针质粒pTK-sR的构建方法，是以所述的质粒pTK-dR为模板，用引物sR-F/sR-R扩增得到的片段经Dpn I酶消化后直接转化E.coliJM109感受态细胞中，得到终止子探针质粒pTK-sR；所述的引物sR-F序列如SEQ ID NO.16所示，sR-R序列如SEQ ID NO.17所示。

3.权利要求1所述的全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统在表征大肠杆菌终止子强度中的应用。