[发明专利]用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明提供了用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组、试剂盒及方法。该引物组包括：与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的外侧引物对F3和B3，及与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的内侧引物对FIP和BIP，用该引物组进行检测时，其检测方法具有灵敏度高、效率高、反应时间短、特异性高、操作简便、结果判定简单等优点，且广泛适用于基层。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组、试剂盒及方法。

背景技术

棘球蚴病，又称包虫病，是由棘球绦虫幼虫—棘球蚴寄生于人和动物体内而引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病。棘球绦虫的成虫寄生于终宿主犬科动物的小肠内,虫体成熟后,虫卵和成熟的孕节片可随粪便排出体外。若被中间宿主(主要是啮齿类动物以及一些家畜如羊、牛、马、猪等)食入活虫卵后,形成幼虫寄生于肝脏、肺脏、腹腔等,犬又通过吞食带有幼虫的内脏而感染。犬作为包虫病的终末宿主，是该病最重要的传染源。

目前，对棘球绦虫的检测主要有传统常规粪便检测法、粪抗原ELISA检测法和PCR分子生物学检测方法。常规粪便检测法繁琐费时，检出率低，且无法从犬粪便中区分细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的虫卵，存在感染操作人员的风险；粪抗原ELISA检测法和PCR均具有较好特异性和敏感性，但是费时费力、所需仪器复杂，不利于基层流行病学的调查和大量样品的检测。因此，建立一种快速、简便、灵敏的能用于细粒棘球绦虫的流行病学调查及现场诊断方法具有非常重要的意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组、试剂盒及方法。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一组用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组，其包括：与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的外侧引物对F3和B3，及与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的内侧引物对FIP和BIP，其特征在于：所述F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

如上所述的用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物在制备检测犬细粒棘球绦虫的LAMP试剂盒或检测试剂中的应用。

本发明还提供了含如上所述用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物的检测试剂盒。

优选地，所述检测试剂盒为LAMP试剂盒，除了包含上述引物组外，还包括：环介导等温扩增缓冲液、阳性对照、阴性对照和/或显色液。

所述阳性对照为犬细粒棘球绦虫DNA阳性样本或国内分离到的犬细粒棘球绦虫DNA提取样本或含SEQ ID NO.5所示或COX2序列。

优选地，所述环介导等温扩增缓冲液为包括有Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、Tween-20、MgSO₄、甜菜碱(Betaine)、脱氧核苷酸(dNTPs)、Bst DNA聚合酶的水溶液。

所述显色液包括SYBR Green I和羟甲基萘酚蓝(HNB)。进一步地，优选地，每2μl显色液所含有溶质的物质的量为：SYBR Green I 0.16μmol，羟甲基萘酚蓝0.3μmol。

进一步，本发明还提供一种采用上述引物的快速检测犬细粒棘球绦虫的LAMP检测方法，是用如上所述的犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物对来自患病或死亡动物的待测样品DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定患病或死亡动物中是否携带犬细粒棘球绦虫；所述环介导等温扩增反应的条件为：63℃、30～60分钟。