[发明专利]一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法及其应用，检测方法包括如下步骤：S1.向可能含蛋白酶的样本和一阴性对照中，加入含有特定氨基酸序列连接的光信号激活分子A或含有它的溶液；S2.孵育一段时间后，检测光信号，检测步骤(1)包括检测含有特定氨基酸序列连接的光信号激活分子A后的样本和阴性对照的光信号強度,比较样本和阴性对照信号的相对信号强度。检测方法可以在制备用于临床诊断病原体感染的试剂盒中应用。当样本中含有待检测蛋白酶活性时，反应中光信号发生变化，即光信号变强、减弱乃至消失，并从光信号的变化判断待检样本中是否含有该蛋白酶活性，操作简单，仅20分钟，即可得到结果。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地涉及一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法及其应用。

背景技术

病原体已经适应在宿主细胞中生存和复制，并从一个个体传播到另一个个体。病原体，特别是病毒，在受感染的人类或动物宿主体内的复制通常依赖于宿主细胞的核酸和/或蛋白质合成机器。然而，由病原体，特别是病毒基因组编码的蛋白质，往往在病原体的生存、复制和传播中起着至关重要的作用。在这些病原体编码的蛋白质中有内肽酶，也称为蛋白酶。

为了有效地整合基因组，病毒通常将病毒蛋白合成为多聚蛋白，每个多聚蛋白包含一个以上的功能蛋白。因此，多聚蛋白必须在一个精确的位置被裂解。在某些情况下，多聚蛋白被宿主细胞的蛋白酶裂解。在其他情况下，病毒多聚蛋白被病毒基因组自身编码的蛋白酶裂解。后一类病毒包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类丙型肝炎病毒(HCV)、冠状病毒(CoV)、西尼罗河病毒(WNV)、寨卡病毒(Zika virus)和登革病毒(DENV)。

由于病毒编码的蛋白酶在特定的裂解位点裂解病毒多聚蛋白，因此病毒蛋白酶一直是抗病毒药物的首选靶点。事实上，许多人致力于开发这些病毒蛋白酶的抑制剂作为抗病毒药物。其中一些抑制剂已经成为抗病毒药物。例如，针对HIV和HCV蛋白酶的蛋白酶抑制剂是重要和有效的抗病毒药物。

荧光测定法被开发并用于筛选病毒蛋白酶抑制剂。通常，这些检测使用合成肽作为底物，其中包含裂解位点氨基酸序列，一端为荧光部分，另一端为猝灭部分。猝灭部分降低荧光或引起荧光部分的波长偏移。当肽底物被裂解时，光信号强度增加和/或峰值波长变化。这些变化可以用荧光计测量。虽然这类方法不灵敏，但由于大量的克隆和纯化的蛋白酶可用于药物筛选试验，因此适用于抑制剂药物筛选。然而，这些检测方法对诊断用途不够灵敏。临床样本中的病毒蛋白酶的含量极为微量，检测微量的病毒酶需要更为灵敏的检测方法。

发明内容

有鉴于此，为解决上述技术问题，本发明的目的在于提出一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法及应用，该方法实质上更灵敏，因此适用于通过检测表明病原体存在的活性蛋白酶来诊断病原体感染。

所采用的技术方案为：

一方面，本发明的一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,包括如下步骤：

S1.向可能含蛋白酶的待检样本及一阴性对照中，加入带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A或含有它的溶液；未带有特定氨基酸序列的独立的完整的光信号激活分子B能产生光信号，且是一种蛋白质；该特定氨基酸序列具有至少一个可以被蛋白酶裂解的裂解位点，使用带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A采用以下方案中的任意一种：

方案一：带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A是光信号激活分子B被该特定氨基酸序列插入到该光信号激活分子B中间的产物；此带有特定氨基酸序列光信号激活分子A仍能产生光信号；当该特定氨基酸序列被蛋白酶切割，将光信号激活分子B切割为第一蛋白和第二蛋白两部分，此第一蛋白和第二蛋白不能产生光信号；