[发明专利]一种土壤中微生物磷脂脂肪酸的固液相高效分离方法

说明书

一种土壤中微生物磷脂脂肪酸的固液相高效分离方法，它涉及一种土壤中磷脂脂肪酸的固液分离方法，本发明是为了解决现有固液相分离不完全、杂质高、误差大、测定精度低的问题的技术问题。本方法如下：将样加入到带盖玻璃试管中，加入柠檬酸钠缓冲液、甲醇、氯仿和Blight‑Dyer提取液，盖上玻璃盖，涡旋，静止，离心，用长嘴胶头吸管吸取上清液转移到另一个带盖玻璃试管中，沉淀，将沉淀后的滤渣，再提取2次，收集所有上清液并合并，即完成固液相分离。本发明与采用常规提取方法相比检测效率提高8‑12％，检出率提高7‑10％。本发明属于土壤中微生物磷脂脂肪酸的固液分离技术领域。

技术领域

本发明涉及一种土壤中磷脂脂肪酸的固液分离方法，尤其是适用于高有机质含量的土壤中微生物细胞中磷脂脂肪酸的提取分离。

背景技术

磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acids,PLFA)是微生物细胞膜的主要组成成分。它只存在于活体微生物细胞中，当微生物死亡后，磷脂会随着细胞膜的降解而消失。该指标能指示不同微生物群落，如细菌、真菌、放线菌和原核生物的群落数量和结构，可用于分析活体微生物群落结构特征，目前已被广泛应用于特定条件下土壤生态系统中微生物群落结构的分析。且随着现代分析技术的发展，该指标可以结合¹³C同位素失踪技术(¹³C-PLFA)，通过质谱分析特定微生物的细胞膜中来源于外源添加有机物质的¹³C丰度和量，定量化研究不同类群的微生物对有机物质的分解利用能力，进而评价不同类群微生物的功能和属性。

目前，中国发明专利已有关于土壤磷脂脂肪酸提取装置或提取方法的阐述，但是都没有对土壤磷脂脂肪酸提取中土壤相和有机相的分离方法进行详细阐述。提取时土壤磷脂脂肪酸是否被全部提取进入有机相，有机相与固体相是否完全分离，会直接影响后续测定数据的准确性和精度，也影响对不同类群微生物群落结构和功能的准确判读。特别地，对于高有机质含量的黑土，其内常常含有大量腐殖化程度较高但未完全变为土壤有机质的植物残体，这部分高分子的化合物密度较低，如果前处理不当，经过氯仿-甲醇相提取液提取，来源于植物的磷脂会进入到有机相中，剩余的植物残体往往会漂浮在固相和有机相界面处，对后续的固液相分离也造成一定的干扰，使土壤磷脂脂肪酸的提取不彻底。申请人在实践中，针对该提取过程中的固体相和有机相不能完全分离，对提取装置和提取方法进行了部分改进，提高了土壤磷脂脂肪酸的提取分离程度，最终找到了利于高有机质含量黑土磷脂脂肪酸充分分离的方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有固液相分离不完全、杂质高、误差大、测定精度低的问题的技术问题，提供了一种土壤中微生物磷脂脂肪酸的固液相高效分离方法。

一种土壤中微生物磷脂脂肪酸的固液相高效分离方法按照以下步骤进行：

一、配制Blight-Dyer提取液：

将氯仿、甲醇和柠檬酸按照1:2:0.8的体积比混合，即得Blight-Dyer提取液；

二、将3g冷冻干燥土样加入到带盖玻璃试管中，加入1.5ml柠檬酸钠缓冲液、3.8ml甲醇、1.9ml氯仿和2ml Blight-Dyer提取液，盖上玻璃盖，得混合液，所述柠檬酸钠缓冲液浓度为0.15mol/L，pH值为4；

三、将步骤二的混合液涡旋2min，静止2h，以3000rpm离心10min，用长嘴胶头吸管吸取上清液转移到另一个带盖玻璃试管中，沉淀；

四、向沉淀后的滤渣内，加入1.5ml柠檬酸钠缓冲液、3.8ml甲醇、1.9ml氯仿和2mlBlight-Dyer提取液，盖上玻璃盖，得混合液，所述柠檬酸钠缓冲液浓度为0.15mol/L，pH值为4；

混合液涡旋2min，静止2h，以3000rpm离心10min，用长嘴胶头吸管吸取上清液转移到另一个带盖玻璃试管中，沉淀；