[发明专利]一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法

说明书

一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，是将含囊泡病毒的待测样品超声破碎，然后稀释、过滤，用其感染对数生长期细胞1h，收集细胞悬液、计算细胞数量，提取总DNA；对上述DNA进行qPCR检测，以含有该片段的pGEM‑T载体为标准品，绘制绝对定量PCR检测的标准曲线。根据样品的Ct值计算出每样品中含有的病毒基因组拷贝数。根据感染复数公式，计算感染每个细胞的平均病毒粒子数量，即感染时病毒与细胞数量的比值计算病毒滴度。本方法测定囊泡病毒滴度，当样品浓度为1×10²～1×10¹¹病毒基因拷贝/mL时检测时间仅需4‑6h，耗时短，与传统的病毒滴度检测方法相比，操作简单快捷，准确，极大提高了囊泡病毒滴度的检测效率，特别适用于囊泡病毒滴度的快速测定。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法。

背景技术

囊泡病毒(ascoviruses)是囊泡病毒科(Ascoviridae)所有毒株的统称，其基因组为环状双链DNA，大小在100-200kb之间。囊泡病毒口服感染率极低，主要依靠寄生蜂携带在鳞翅目幼虫个体间传播。囊泡病毒侵染宿主幼虫后宿主幼虫表现为生长发育迟缓、肌肉弹性降低、取食量减少等症状，宿主幼虫感染后期，包含病毒粒子的囊泡被释放到血淋巴中，宿主幼虫血淋巴由无色透明变成乳白色，形成囊泡病毒感染的典型症状。囊泡病毒对宿主细胞的感染过程，始于细胞核的急剧增大，随着核膜凹陷，细胞增大至健康细胞的5-10倍，细胞膜、质膜等内陷部分逐渐相互连接，将原宿主细胞割裂形成20-30个封闭的小室，成熟的病毒粒子被包含在这些小室中，最后变成包含有病毒粒子的囊泡，也称病毒囊泡。由于囊泡病毒特殊的细胞病理学特征，迄今未有较为理想的囊泡病毒滴度测定方法，严重影响了囊泡病毒及相关学科的研究进程。

目前测定病毒滴度的方法主要有蚀斑法和终点稀释法，以及最近发表的测定囊泡病毒滴度的台盼蓝染色法。

1)蚀斑法(plaque assay)是经典且被广大实验人员认可的测定病毒滴度的方法。每个蚀斑都是由单个感染性病毒颗粒形成的，计数含有适当数目蚀斑的培养皿，原样品中感染病毒的浓度可以根据系列梯度计算出来。但该方法所需实验时间长，对细胞状态要求高，需要操作人员具有丰厚的实验操作经验。但在蚀斑实验时易发生蚀斑重叠，或母斑产生子斑，减少或增加蚀斑数，致使实验可重复性不高。

2)终点稀释法(end-point dilution assay)以半数组织培养感染剂量(TCID50)表示，即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathic effect,CPE)所需的病毒量，该方法主要通过显微镜来观察细胞病变来确定病毒的滴度。但囊泡病毒感染初期引起的细胞病变并不明显，故易发生错误识别细胞病变(CPE)导致病毒滴度测定错误，为此依照传统的终点稀释法测定囊泡病毒滴度有很大缺陷。

3)台盼蓝染色法是用台盼蓝染料染色被囊泡病毒感染的细胞，死亡细胞被染成蓝色，活细胞则不被染色，通过计数细胞染色率来确定病毒滴度。但细胞染色结果计算易受染色时间、染色液浓度等影响，且该方法工作量大，需要短期内染色并计算不同稀释度下几百组细胞染色率，计数过程复杂并且耗时耗力，还有该方法实验时间较长，对实验环境整体要求较高。

综上所述，从囊泡病毒的研究利用来看，由于现有病毒滴度检测方法的明显缺陷及囊泡病毒特殊的病理特征，尚没有一种快捷、准确的方法来测定囊泡病滴度。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提供的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，本方法与传统的病毒滴度检测方法相比，操作简单快捷，准确，极大提高了囊泡病毒滴度的检测效率，特别适用于囊泡病毒滴度的快速测定。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，该方法步骤如下：

1)病毒的收集及样品的处理：收集感染囊泡病毒的待测样品，超声破碎，用培养基稀释后过滤；