[发明专利]一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法

权利要求书

1.一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，该方法步骤如下：

1）病毒的收集及样品的处理：收集感染囊泡病毒的待测样品，超声破碎，稀释后过滤；其中，囊泡病毒为HvAV；

2）细胞感染及计数：将昆虫细胞接种于6孔板中，加入步骤1）得到的囊泡病毒稀释液，恒温箱培养，收集囊泡病毒细胞，计数；

3）病毒基因组拷贝数的计算：以步骤2）收集到的细胞提取基因组DNA，以提取的DNA为模板进行绝对定量PCR检测；以含有该DNA片段的pGEM-T载体为标准品，绘制绝对定量PCR检测的标准曲线；对待测样品进行qPCR检测，根据所产生的Ct值基于该标准曲线计算样品中含有的病毒基因组拷贝数；其中，绝对定量PCR检测囊泡病毒HvAV的引物序列为：AV-F：ATGAAAGCCGTGCTTAACGT，AV-R：CTAGCCGGTGTGGTGGGTGT；

4）囊泡病毒滴度计算：基于步骤3）得到的病毒基因组拷贝数及步骤2）的病毒细胞数量，病毒基因组拷贝数等于病毒粒子数，根据感染复数公式，计算感染每个细胞的平均病毒粒子数量，即得样品中的囊泡病毒滴度。

2.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，所述步骤3）中绝对定量PCR检测所用引物是对应所述病毒设计的。

3.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，所述骤3）中绝对定量PCR扩增反应体系为：SYBR Primix Ex Tap II：5μL，DNA模板：0.5μL，上游引物：0.4μL，下游引物：0.4μL，加水至10μL。

4.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，所述骤3）中绝对定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性1s，然后95℃10s、55℃10s、72℃35s，共40个循环。

5.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，所述步骤1）待测样品稀释液中囊泡病毒浓度为1×10 ²～1×10¹¹病毒基因拷贝/mL。

6.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，所述步骤2）中昆虫细胞为草地贪夜蛾卵巢细胞Sf9细胞、草地贪夜蛾卵巢细胞Sf21细胞或甜菜夜蛾脂肪体细胞系SeFB细胞。

7.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，所述步骤2）中昆虫细胞的个数为1.0～9.9×10⁵个/mL。

8.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，所述步骤2）培养温度为27℃，时间为1h。