[发明专利]猪Delta冠状病毒病毒样颗粒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种猪Delta冠状病毒病毒样颗粒及其制备方法和应用，首先设计并扩增猪Delta冠状病毒结构蛋白基因，并利用结构蛋白基因构建重组穿梭质粒，利用重组穿梭质粒构建重组杆粒，将重组杆粒转染Sf9细胞，得到表达猪Delta冠状病毒结构蛋白的重组杆状病毒，将重组杆状病毒感染Sf9细胞，纯化，得到猪Delta冠状病毒样颗粒；本发明的制备方法使用无血清培养的Sf9细胞表达制备，结合蔗糖密度溶液超速离心获得PDCoV‑VLP病毒样颗粒，该PDCoV‑VLP病毒样颗粒具有完整性，免疫原性好，免疫动物产生抗体滴度和安全性高的优点，可用于猪Delta冠状病毒病毒病的预防，故具有良好的开发和应用前景。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种猪Delta冠状病毒病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

对2010年以来我国爆发了以哺乳仔猪的高死亡率为特征的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)，疫情波及十几个省份，致使100万仔猪死亡。同样，PED在美国等地也频频流行发生，严重影响世界养猪业的发展。对于PED致病原的研究发现，新发猪Delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)和猪流行性腹泻病毒(porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)是引发该病的重要病原，且两种病毒存在共感染现象。

电子显微镜下观察，PDCoV呈球形或椭圆形，囊膜外有冠状棘突，病毒颗粒大小为150-180nm。PDCoV基因组是单股正链RNA。根据目前已经测定的PDCoV全基因组序列，病毒基因组大小约为25.4kb，G+C百分含量约为43％，是已知含有最小基因组序列的冠状病毒。PDCoV基因组主要包括两端的非编码区(Untranslated region，UTR)，即5’-UTR和3’-UTR以及多个开放阅读框(Open reading flame，ORF)。PDCoV基因组大部分序列编码两个重叠的ORF1a和ORF1b，分别编码多聚蛋白pp1a和pp1ab。PDCoV基因组剩余序列主要编码病毒结构蛋白，依次包括表面纤突蛋白(Spike，S)、小包膜蛋白(Small membrane，E)、膜蛋白(Membrane，M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)。目前，对于新发现的猪Delta冠状病毒的疫苗研制尚无报道。

病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)疫苗可诱导体液免疫和细胞免疫应答，通过鼻腔内接种或口服免疫可极大提升局部粘膜的免疫保护效果。VLP又称伪病毒或假病毒，是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白通过自组装形成的空心颗粒，在形态上与真正病毒粒子相同或相似，保留了病毒原有的抗原表位和空间构象，但不含有病毒基因组，故不能自主复制，因此无致病性。由于其具有与完整病毒相似的免疫原性，且颗粒呈现纳米大小，通过激活抗原提呈细胞，可诱导多种类型的免疫应答，特别是粘膜免疫，并且具有良好的免疫原性和较高的安全性等特点，目前已经成为研制用于人或动物病毒性感染疾病的潜在的安全高效候选疫苗之一。

综上所述，目前亟待研发一种能够高效、安全、低成本地制备猪Delta冠状病毒病毒样颗粒的方法，为防控PDCoV的感染提供疫苗。

发明内容

针对现有技术中目前尚无用于防控PDCoV感染的安全有效的疫苗问题，本发明的首要目的是提供一种猪Delta冠状病毒病毒样颗粒。

本发明的第二个目的是提供上述猪Delta冠状病毒病毒样颗粒的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述猪Delta冠状病毒病毒样颗粒的应用。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种猪Delta冠状病毒结构蛋白基因，其包括结构蛋白S基因、结构蛋白E基因、结构蛋白M基因和结构蛋白N基因并分别进行扩增；

结构蛋白S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；