[发明专利]一种抗草铵膦牛筋草种群的突变位点、引物及检测方法和应用

权利要求书

1.一种检测抗草铵膦牛筋草种群的突变位点的dCAPs引物，其特征是：该引物包括上游引物dCaps-GS1-F和下游引物dCaps-GS1-R，所述上游引物dCaps-GS1-F的碱基序列如SEQIDNO：7所示，所述下游引物dCaps-GS1-R的碱基序列如SEQ ID NO：8所示，所述突变位点位于从草铵膦敏感型牛筋草中克隆的靶标酶谷氨酰胺合成酶基因EiGS1-S的如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第175位，发生的突变为A-G。

2.一种抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，其特征是包括以下步骤：

(1)选取待测牛筋草种群样品和草铵膦敏感型牛筋草种群，提取其基因组gDNA；

(2)根据抗草铵膦牛筋草种群中靶标酶谷氨酰胺合成酶基因EiGS1-S的第175位核苷酸由A突变为G，设计权利要求1中所述的dCAPs引物，用以扩增突变位点前后约200bp的核酸片段；

(3)利用该dCAPs引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；

(4)用核酸内切酶Kpn Ⅰ-HF酶切PCR产物；

(5)将酶切PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，根据电泳结果鉴定待测样品是否为在第175位具有A-G突变的抗草铵膦突变位点的牛筋草种群；若待测牛筋草种群样品中EiGS1基因核酸序列在第175位发生A-G突变，则会被Kpn Ⅰ-HF切掉部分片段，与未发生突变的EiGS1片段相比，电泳时会跑的较快，电泳位置在未被酶切的片段的下方，从而达到快速鉴定的目的。

3.根据权利要求2所述的抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，其特征是：步骤(3)中PCR反应体系如下：2×PCR Buffer 12.5μL，10μM的dCaps-GS1-F和dCaps-GS1-R引物各1μL，牛筋草gDNA 2μL，加入8.5μL无菌蒸馏水至反应体系为25μL。

4.根据权利要求2所述的抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，其特征是：步骤(3)中PCR程序如下：95℃4min，94℃30s，58℃30s，72℃30s 40个循环，最后72℃延伸7min。

5.根据权利要求2所述的抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，其特征是：步骤(4)中KpnⅠ-HF酶切时反应体系如下：10×NEB.Custmer Buffer 3μL，KpnⅠ-HF 1μL，PCR扩增产物15μL，ddH₂O 11μL，总体积30μL。

6.根据权利要求2所述的抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，其特征是：步骤(5)中琼脂糖凝胶电泳为质量百分含量为2％的琼脂糖凝胶。

7.权利要求1中的引物在制备用于检测抗草铵膦牛筋草种群的生物制剂中的应用。