[发明专利]一种基于线性双链DNA分子在哺乳动物细胞系内构建单域抗体库的方法

说明书

本发明提供了一种基于线性双链DNA分子于哺乳动物细胞系内构建单域抗体库的方法，包括如下过程：步骤一：制备含有编码单域抗体互补决定区(CDR)随机氨基酸序列的核苷酸序列的上、下游线性双链DNA；步骤二：将步骤一获得的上、下游线性双链DNA转染到哺乳动物细胞系中，上、下游线性双链DNA之间发生连接，生成能够产生单域抗体的全长线性双链DNA。本发明开发了在哺乳动物细胞内建立单域抗体库的新方法，所产生单域抗体库其复杂性来自于1)PCR过程中将随机氨基酸编码序列引入上、下游线性双链DNA；2)上、下游线性双链DNA之间发生的随机连接反应。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及抗体库构建，尤其是一种单域抗体库的构建方法。

背景技术

抗体(antibody)，又称免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)，是一种主要由浆细胞分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等病原体的大型蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。由于其对抗原具有良好的特异性的识别及结合能力，近年来抗体被不断开发应用于疾病诊断及治疗、分子影像学、分子生物学等领域。

单域抗体(single-domain antibody,sdAb)又称做纳米体(nanobody，Nb)，是在骆驼科及鲨鱼科动物血清中大量存在的一种天然抗体。与常规抗体不同，单域抗体没有轻链，仅通过重链(heavy chain)就可以完成对抗原的识别与结合。单域抗体包含重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH)和两个恒定区(CH2、CH3)。重链可变区(VHH)是结合抗原的结构域，结构解析结果显示VHH半径只有2.4纳米，高4纳米，因此也被称作纳米体(nanobody)。VHH分子量只有12-15kDa，是目前已知的可结合抗原的最小单位。重链可变区(VHH)含有三个互补决定区(complementary determiningregion,CDR)，是与抗原直接结合的区域，决定着抗体识别特异性与结合能力。不同单域抗体的CDR氨基酸序列不同，其共同构成了单域抗体的多样性。

与常规抗体相比，单域抗体具有以下优点：1)免疫原性弱；2)可溶性高、耐受性强；3)组织渗透性强；4)表达高效、纯化简单；5)改造容易。目前，针对特定抗原的单域抗体主要利用噬菌体展示(phage display)、酵母展示(yeast display)等高通量技术筛选获得。这些高通量技术基于所展示单域抗体与抗原之间的物理结合属性，从大量的候选随机单域抗体库中筛选获得，所筛选到的抗体具有高亲和力，但不能对所展示抗体进行翻译后修饰(如糖基化修饰)。同时，这些高通量技术尚不能在哺乳动物细胞系中实现。这大大限制了其应用范围，尤其是针对靶向G蛋白偶连受体(G protein-coupled receptor,GPCR)、离子通道(ion channel)、酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase,RTK)等跨膜蛋白的单域抗体的筛选。由此，为了便于在哺乳动物细胞内建立单域抗体的筛选体系，需要建立一种在哺乳动物细胞系内构建单域抗体库的方法。

为实现对跨膜蛋白进行展示筛选，2014年美国Scripps研究所Lerner课题组开发出一种哺乳动物细胞系中的自分泌信号系统(autocrine-based signaling system)。这项技术通过血小板源生长因子受体跨膜结构域(PDGFR-TM)，将候选抗体展示于哺乳动物细胞表面，结合目标跨膜蛋白的功能报告系统，利用流式细胞术与高通量测序筛选靶向跨膜蛋白的抗体激动剂。