[发明专利]一种基于线性双链DNA分子在哺乳动物细胞系内构建单域抗体库的方法

权利要求书

1.一种基于线性双链DNA分子构建单域抗体库的方法，包括如下过程：

步骤一：制备含有编码单域抗体互补决定区（CDR）随机氨基酸序列的核苷酸序列的线性双链DNA，所述编码单域抗体互补决定区（CDR）随机氨基酸序列的核苷酸序列的线性双链DNA的数目至少为2条；所述含有编码单域抗体互补决定区（CDR）随机氨基酸序列的核苷酸序列的线性双链DNA包含单域抗体互补决定区1（CDR1）随机序列、单域抗体互补决定区2（CDR2）随机序列或单域抗体互补决定区3（CDR3）随机序列的至少一种； CDR1随机序列和/或所述CDR2随机序列包含的CDR的随机序列为（mnn）_x，其中n代表T、C、A、G四种碱基的一种，比例为1：1：1：1；m代表C、 A两种碱基的一种，比例为1：1；x代表引物中含有mnn密码子的个数，x≥2； CDR3随机序列包含的CDR随机序列为（nnk）_y，其中n代表T、C、A、G四种碱基的一种，比例为1：1：1：1；k代表T、G两种碱基的一种，比例为1：1；y代表引物中含有nnk密码子的个数，y≥2；

步骤二：将步骤一获得的线性双链DNA转染到哺乳动物细胞中，所述至少2条编码单域抗体互补决定区（CDR）随机氨基酸序列的核苷酸序列的线性双链DNA在哺乳动物细胞内连接为表达单域抗体的完整产物；

通过PCR的方法将所述CDR1随机序列、所述CDR2随机序列或所述CDR3随机序列中的至少一种引入所述含有编码单域抗体互补决定区（CDR）随机氨基酸序列的核苷酸序列的线性双链DNA；所述编码单域抗体互补决定区（CDR）随机氨基酸序列的核苷酸序列的线性双链DNA包括上游产物和下游产物两段序列，所述CDR1随机序列、所述CDR2随机序列分布于所述上游产物；所述CDR3随机序列分布于所述下游产物上；

所述 PCR 反应的引物包括随机肽和单域抗体骨架部分：所述上游产物对应的引物序列中，所述随机肽序列为（mnn）_x，所述随机肽分别包含于所述CDR1随机序列和所述CDR2随机序列中，所述单域抗体骨架部分包括Seq ID NO:2 所示的核苷酸序列中第1至第9碱基和第37至第87碱基；所述下游产物对应的引物序列中，所述随机肽序列为（nnk）_y，所述单域抗体骨架部分包括 Seq ID NO:3 所示的核苷酸序列的第1至第102碱基；

上游产物与下游产物在哺乳动物细胞内连接位点为所述上游产物中Seq ID NO:2 所示的核苷酸序列中第1个碱基与所述下游产物中Seq ID NO:3 所示的核苷酸序列的第1个碱基。

2.如权利要求1所述的构建单域抗体库的方法，其特征在于，将所述CDR1随机序列和所述CDR2随机序列引入线性双链DNA的引物序列包含的CDR的随机序列为（mnn）_x，其中n代表T、C、A、G四种碱基的一种，比例为1：1：1：1；m代表C、 A两种碱基的一种，比例为1：1；x代表引物中含有mnn密码子的个数，x≥2。

3.如权利要求2所述的构建单域抗体库的方法，其特征在于，将所述CDR3随机序列引入线性双链DNA的PCR引物序列包含的CDR随机序列为（nnk）_y，其中n代表T、C、A、G四种碱基的一种，比例为1：1：1：1；k代表T、G两种碱基的一种，比例为1：1；y代表引物中含有nnk密码子的个数，y≥2。

4.如权利要求1-3任一项所述的构建单域抗体库的方法，其特征在于，

步骤一、通过PCR反应分别扩增得到含有CMV启动子、单域抗体互补决定区1（CDR1）、单域抗体互补决定区2（CDR2）的上游PCR产物；和含有单域抗体互补决定区3（CDR3）、poly Asignal的下游PCR产物；所述上游PCR产物和所述下游PCR产物为所述线性双链DNA分子；将上游PCR产物和下游PCR产物进行纯化；

步骤二、将上游PCR产物和下游PCR产物的纯化产物同时转染入哺乳动物细胞中，转染细胞经培养后被收集，用于提取RNA并反转录成cDNA，最后PCR扩增单域抗体互补决定区1-3（CDR1-3），进行深度测序。

5.如权利要求4所述的构建单域抗体库的方法，其特征在于，所述PCR反应的模板包括Seq ID NO:7和/或Seq ID NO:8所示的核苷酸序列。