[发明专利]一种应用于动物组织中核酸现场提取方法

说明书

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种应用于动物组织中核酸现场提取方法。其中的组织裂解采用的提取试剂为SEMP液、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和Trizol的混合液，体积比为4:1:4:2；漂洗和洗脱时采用核酸吸附材料作为载体。本方法不需要任何复杂的制造或专门的设备(例如移液器、离心机或金属浴等)，可在1～3分钟提取出与标准的商业化核酸提取试剂盒无显著差异的质量浓度核酸；所得的核酸可直接用于LAMP、PCR、RT‑PCR、qRT‑PCR等不同的分子诊断和检测实验。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种应用于动物组织中核酸现场提取方法。

背景技术

从诊断到基因分型，核酸扩增在世界各地的实验室中已被证明是必不可少的。任何旨在扩增DNA或RNA的应用中的第一步都是从复杂的生物样品中提取核酸，尤其涉及动物组织中核酸的提取；传统上，这项任务需要专门的设备(如离心机、金属浴、磁力架等)，训练有素的技术人员以及多个液体处理步骤。当前核酸分离方法的这种复杂性限制了现阶段实验室环境之外许多DNA扩增技术的使用。

由于对更简单、更快速的核酸纯化方法的需求，目前有关核酸提取的商品化试剂盒层出不穷。这些试剂盒中的绝大多数是基于在离液盐存在下核酸与固体二氧化硅支持物的结合；然后，通过一系列洗涤和离心步骤除去污染物，最后在低盐溶液中从二氧化硅洗脱核酸。此外，具有多种旨在捕获和纯化核酸的功能化修饰表面化学物质的超顺磁性氧化硅纳米磁珠也已商业化。磁珠法核酸提取的操作步骤主要包括裂解、结合、洗涤、分离四部分，提取时使用磁力架(或磁铁)将磁珠吸引并固定在试管的侧面，以便在洗涤和洗脱步骤中去除上清液，从而摆脱了对离心机的需要。即使基于磁珠法的核酸纯化相对较快(约20分钟)并且不需要电气设备，但对于在现代实验室环境之外进行的应用(如基于采样现场或附近即刻进行分析)，它仍然过于复杂。

本课题组前期基于Cards,Whatman^TM(GE Healthcare,USA)生产的核酸现场提取试剂盒可用于对虾组织核酸的快速提取，整个过程只需10-20分钟，中途无需过柱离心等烦琐步骤，通过直接从核酸吸附材料中扩增核酸而消除了对单独的核酸洗脱步骤的需要。然而，尽管省去了洗脱步骤，但核酸吸附材料需要经70-95℃变性5分钟处理，不但增加了提取时间，而且需要加热设备(如，恒温金属浴)；此外，在用于实时荧光检测实验中，反应管中的核酸吸附材料会影响荧光值的读取，这些再次限制了这一方法在现场检测中的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有的无论是磁珠法核酸提取还是核酸现场提取试剂盒都存在或是操作复杂，或是提取时间长、需要加热等问题，不能满足对更简单、更快速的核酸纯化方法的需求。

为了解决这些问题，我们提供了一种应用于动物组织中核酸现场提取方法，该方法不需要任何复杂的制造或专门的设备(例如移液器、离心机或金属浴等)，可在1～3分钟提取出与标准的商业化核酸提取试剂盒无显著差异的质量浓度核酸；所得的核酸可直接用于LAMP、PCR、RT-PCR、qRT-PCR等不同的分子诊断和检测实验。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：一种应用于动物组织中核酸现场提取方法，其中的组织裂解采用的提取试剂为SEMP液、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和的混合液，体积比为4:1:4:2；漂洗和洗脱时采用核酸吸附材料作为载体。

SEMP液作为样品保存液，可防止样品核酸的降解；3M醋酸钠在核酸提取中，可调节盐离子的浓度，中和核酸分子的负电荷，便于加入乙醇后使DNA沉淀下来；异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质,主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放，提取RNA和DNA；试剂是一种完全的即用型试剂，可用于提取高质量的总RNA或者从各种生物样本中同时提取RNA、DNA和蛋白质。这种酚和异硫氰酸胍单相溶液，可用于提取人、动物、植物、酵母或细菌来源的细胞和组织样本中的纯RNA、DNA和蛋白质。