[发明专利]PCDA囊泡结合CRISPR的快速检测系统及其方法

说明书

本发明公开了一种PCDA囊泡结合CRISPR的快速检测系统，所述系统包括检测目标物质的试剂R1和R2，所述R1包含待检测的物质或该物质的相关基团，所述R2包含靶DNA，Cas蛋白‑sgRNA复合物和PCDA囊泡。本发明的检测方法具有以下优势：(1)测试无需特殊仪器，定性测定时仅凭肉眼可视；(2)操作简单、快速，非均相测试，无需酶标记和分离；(3)方法灵敏，结果准确，且样品处理简单，检测费用较低。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及PCDA(10,12-pentacosadiynoic acid,10,12-二十五碳二炔酸)囊泡结合CRISPR的快速检测系统及其方法。

背景技术

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,成簇规律间隔短回文重复序列)是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器。简单说就是，病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR-Cas9系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的基因组上切除，这是细菌特有的免疫系统。

博德研究所(Broad Institute)是隶属美国麻省理工学院(MIT)和哈佛大学的一个高水平基因组学研究中心，该研究所的张峰团队正在努力开发CRISPR-Cas13分子诊断技术。与用于基因编辑的Cas9蛋白不同，Cas13蛋白在切割靶序列后会不加选择地切割所碰到的RNA—“附带切割”(collateral cleavage)；这一特性使其不能被用于基因编辑，但对诊断来说却是个福音，该切割能增加检测信号的灵敏度。2018年，他们把这种诊断技术命名为SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking,特异性高灵敏度酶促解锁)，该系统包含Cas13、对应的靶向待检测病毒的sgRNA和包含一个切割后可发出荧光的报告RNA链；当这些Cas13蛋白识别到靶向RNA链时会切割相应的模板，随后激活了它的“附带切割”活性，进而切割报告RNA并释放可检测的荧光信号。

加州大学伯克利分校的Doudna团队发现当Cas12a蛋白在剪切靶向的dsDNA后能高效地切割非特异性单链DNA(ssDNA)，基于此开发了DETECTR(DNA endonuclease targetedCRISPR trans reporter,DNA内切酶靶向CRISPR反向报告)技术；该系统包含Cas12a、靶向特定序列的sgRNA和非特异性ssDNA荧光报告序列(FQ-labeled reporter)。一旦Cas12a检测到目的DNA序列便会切割靶序列，接着荧光报告序列也会被切割，从而释放出荧光信号。目前CRISPR诊断主要用于分子诊断，包括病毒、微生物、cfDNA等。

聚联乙炔(polydiacetylenes,PDA)囊泡由于其特殊的光学性质受到广泛关注。联乙炔(diacetylenes)也称二乙炔或丁二炔，由于自身是两亲分子，其会以囊泡的形式存在于溶液中，紫外光照射下联乙炔分子中两个相邻炔基通过1，4-加成反应生成聚联乙炔；可见光激发其分子骨架离域电子，使其产生π-π*跃迁，溶液显示为蓝色，紫外-可见光谱中最大吸收约为650nm。

聚联乙炔(PDA)具有独特的性能优势，主要体现在以下几方面：首先，PDA可以由联乙炔如10,12-二十五碳二炔酸(PCDA)单体通过UV或γ辐射自组装制备，在聚合期间不需要加入催化剂或引发剂，产物PDA聚合物纯度很高；第二，受到特异性环境刺激时，蓝色PDA囊泡溶液(最大吸收波长约640nm)可以变为红色(最大吸收波长约550nm)，并且这种颜色转变可以通过肉眼直接观察到；第三，蓝色状态的PDA囊泡不具有荧光性能，而它们的红色状态是有荧光的，这使得聚联乙炔更适用于开发荧光传感器外界环境变化。