[发明专利]一种用于检测山羊支原体山羊亚种的引物和探针

说明书

本发明提供一种用于检测山羊支原体山羊亚种的引物和探针，所述引物序列为上游引物：5’‑GCTAGTTGGAATATATGATAATG‑3’，下游引物：5’‑CCACCTGCTAATCCTAAA‑3’，所述探针序列为：5’‑AATCAACTTCAACATTAGGTCTGCAA‑3’。本发明于国内外首次建立山羊支原体山羊亚种的TaqMan实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好。

技术领域

本发明涉及一种用于检测山羊支原体山羊亚种的引物和探针，属于分子生物学领域。

背景技术

山羊支原体山羊亚种(Mycoplasma capricolum subsp. capricolum, Mcc)是丝状支原体簇的成员之一，是引起山羊传染性无乳症(caprine contagious agalactia,CCA)的主要病原之一。关于CCA的报道最早可追溯到上世纪90年代，Monneratd等首次对山羊支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp）首次对两者进行分析比较，西班牙De la Fe等于2007年首次在西班牙分离到。关于该病的研究报道较少，主要原因是由于其分离率较低，且引起CCA的主要病原还有无乳支原体、丝状支原体丝状亚种和腐败支原体等，目前关于该病的全基因序列仅有1株，是美国Glass等于2005年上传至GenBank上的，2014年才公布。我国目前尚未有该病发生的报道，然为了防范于未然，本发明根据GenBank上公布的山羊支原体山羊亚种AF086703.1的lppA基因序列首次建立了山羊支原体山羊亚种实时荧光定量PCR方法，用于鉴定山羊支原体山羊亚种引起的CAA。本发明的建立可以填补该领域的空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测山羊支原体山羊亚种的引物和探针。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

1、一种用于检测山羊支原体山羊亚种的实时荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’- GCTAGTTGGAATATATGATAATG -3’，

下游引物：5’- CCACCTGCTAATCCTAAA -3’。

2、一种用于检测山羊支原体山羊亚种的探针，所述探针序列为： 5’-AATCAACTTCAACATTAGGTCTGCAA-3’。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。

利用本发明的引物和探针可用于检测山羊支原体山羊亚种，尤其适用于基于实时荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立了一套可用于检测山羊支原体山羊亚种的实时荧光定量PCR方法。具体操作方法如下：

1、引物设计：根据GenBank上公布的山羊支原体山羊亚种CP000123.1全基因序列，通过筛选比对最终选定MCAP_0033基因作为目的基因，利用Beacon Designer 7.9 软件进行引物和探针设计，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为Eclipse，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。

2、反应体系的优化：优化出的25μL最佳反应体系为：Premix Ex Taq^TM（ProbeqPCR）12.5μL、上、下游引物（10 μmol/L）各1μL、探针（5 μmol/L）1μL、模板2μL、水补足至25μL。最佳反应条件为：95℃，10s 预变性；95℃ 5s，54℃ 10s，72℃ 20s共40 个循环。