[发明专利]结直肠癌肿瘤微环境检测试剂、试剂盒、装置及应用

说明书

本发明提供了一种结直肠癌肿瘤微环境检测试剂、试剂盒、装置及应用。该检测试剂包括POLE基因突变检测试剂以及如下至少一个组合中的至少一个分子标志物的抗体：组合1：CD3、CD8、CD45RO、PD‑1及PD‑L1；组合2：CD4、FOXP3、CD68、CD163、PD‑L1及CD57。利用本申请发现POLE基因突变与上述部分分子标志物的高表达显著相关，确定了POLE基因突变与结直肠癌肿瘤微环境的关系，从而便于综合利用多重免疫组化法同时标记多个分子标志物及在检测胰腺患者肿瘤微环境方面检测灵敏度高，特异性好的优势，相对准确地预测检测对象是否有较高概率的5年生存率。

技术领域

本发明涉及多重免疫组化检测领域，具体而言，涉及一种结直肠癌肿瘤微环境检测试剂、试剂盒、装置及应用。

背景技术

现有的免疫组化常用二氨基联苯胺(即3,3，-diaminobenzidine，DAB)显色，其原理是因为二氨基联苯胺是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累，形成棕褐色不溶性产物。DAB主要和蛋白质的NH2或SH基团结合，形成稳定的N-N键或N-S键，然后DAB中的显色基团就能显示出颜色，标记到已经暴露的蛋白质上，从而显示目标细胞的蛋白质分布及种类等。现有技术在一张切片上一般标记一个分子。

多重免疫组化(mIHC,multiple immnohistochemistry)分析：能在一张组织切片上标记多个免疫细胞及免疫检查点分子(n≤6，n表示分子标记或抗原标记的数量)。

第一个分子(抗原)标记：同传统免疫组织化学基本原理，一抗识别抗原，带有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)的二抗结合一抗，随后在含有H2O2的反应中，带有荧光基团的酪胺盐(Tyramide)，在辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)催化下形成含有共价键结合位点酶促产物，与周围(包括抗原上、一抗上和二抗上)的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的Tyramide-荧光基团，抗原越多，Tyramide-荧光基团越多，其检测信号越强。

第n个分子(抗原)标记：在每个抗原标记循环结束后，使用微波法去除上一轮的一抗，二抗(由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离。微波法对标记在抗原上的酪胺盐荧光信号影响甚小，所以可以在保证上一轮标记信号不丢失的前提下，彻底去除上一轮抗体，而不会对下一轮标记造成干扰。此步骤较易实现)。洗脱去除非特异性标记，进行下一轮标记，从而实现多重免疫组化分析。

优势：同一张切片上可以标记多个分子。多个分子标记的过程中，可以用相同种属来源的不同一抗，以顺次单标的方式将带有不同波长荧光基团的酪胺盐共价结合到目标抗原上(对抗原直接进行标记)，随后通过微波加热去除抗体(抗体没了但荧光信号仍留在抗原上)。清除上一轮抗体后即可使用新的抗体继续染色，无需担心交叉反应。

多重免疫组化标记之后，多光谱成像需特定的分析仪器达到多重免疫组化分析的目的。多光谱成像依赖于光谱数据采集和光谱拆分计算两个过程。光谱数据采集：多光谱数据采集的技术手段有很多种，比如光栅分光、棱镜分光、液晶可调谐滤波器分光等等。运用PerkinElmer公司的Vectra系统(液晶可调滤波器，LCTF)过滤采集特定波段的光谱信号。LCTF由液晶材料组成，通过调整附加的电压改变光线在晶体中的光程，选择性输出特定波长的光信号，实现分光的目的。CCD曝光配合LCTF的连续滤波，就可以准确记录不同波长段的图像信号。

光谱拆分：光谱图像的每个像素点信号都是不同染料和样本自发信号的叠加，以每种染料的光谱特征曲线为标准，通过数学方法对光谱图像中叠加的信号进行还原运算，从而获得单通道图像的过程称为光谱拆分计算。光谱拆分计算是整个光谱成像不可缺少的重要环节，直接影响数据结果的准确性。