[发明专利]一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法

说明书

本发明提供了一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法，在角蛋白底物处理、制胶、电泳及水解条带显色步骤做了改进，包括(A)将10g角蛋白底物和500ml有机溶剂加入回流冷凝装置中，于80‑100℃消煮60‑100min；用两倍体积经4℃预冷的丙酮沉淀角蛋白；离心收集角蛋白沉淀，清洗后于4℃晾干；(B)在制备分离胶时，加入由(A)处理所得角蛋白底物，使得其质量百分含量为0.1％，然后于室温下以100r/min的速度搅拌1h，离心取上清，进行配置质量浓度为12％的分离胶。本发明克服了传统酶谱方法底物特异性低、水解条带区分度低、灵敏度低等局限，提供了一种准确、灵敏的检测角蛋白酶活力的酶谱方法。

技术领域

本发明属于蛋白酶检测领域，具体涉及一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法。

背景技术

畜禽养殖生产中会产生大量角蛋白(keratin)废弃物，如羽毛、皮毛、角、蹄、爪等。角蛋白是一类硬性纤维状蛋白，它的结构通过二硫键、氢键，盐键和肽键相互作用来维系，不易溶解和消化。传统的物理化学方法处理角蛋白废弃物不仅转化率低，易破坏角蛋白的营养成分，还会造成环境污染。角蛋白降解微生物能够产生一类具有角蛋白水解活性的酶，1963年Nickerson等(Nickerson WJ,et al.Biochimica et Biophysica Acta,1963,77(1):73-86)将具有降解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶。目前发现的多数角蛋白酶具有广泛的底物范围，除了能够降解角蛋白外，还可以降解多种可溶性蛋白质，如胶原蛋白、弹性蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白等。研究显示，用化学合成的对硝基苯胺(para-nitroanilide)作为底物，角蛋白酶主要在P1位点切割疏水性芳香族氨基酸(Silveira ST,et al.Journalof Chemical Technology and Biotechnology,2009,84(3):361-366)。角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽、氨基酸及矿物元素，可以用于制造有机肥料以及饲料添加剂，这不仅解决了目前国内农业和畜牧业资源紧缺的难题，还降解了污染源，有利于改善环境。然而，如何快速鉴定与检测角蛋白酶资源，一直是角蛋白酶开发利用的瓶颈。

酶谱法(Zymogram technique)是用于检测蛋白水解酶的电泳技术，基于特异性底物与丙烯酰胺共聚合来实现酶的特异性检测。随着技术进步，酶谱分析方法又衍生了许多新的技术，包括凝胶酶谱法、原位酶谱分析法、体内酶谱法等。其中，凝胶酶谱法是用于检测蛋白酶活性的最常用手段，其原理大致为：先将目标检测酶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(含特异性底物)电泳分离；在电泳过程中，SDS与目标检测酶结合(可逆结合)，破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥水解作用；电泳结束后，将胶置于Trition中洗脱，由于SDS被Trition结合而去除，从而使酶恢复了活性，在各自的迁移位置发挥水解作用；最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，在蓝色背景下可出现酶的水解白色条带，条带的强弱与酶活性成正比。根据制胶过程中，在分离胶中加入的底物不同，从而能特异性检测不同的酶类。该方法具有检测结果直观、能对目标检测酶定量和定性分析等优点，因此被广泛用于蛋白酶检测技术领域。

然而，针对于某些特殊蛋白酶的检测(如：角蛋白酶)，凝胶酶谱法存在一些技术上的不足：(1)常用底物特异性低，无法针对性的检测具有广泛水解能力的角蛋白酶；(2)由于角蛋白底物的特殊性，直接加入角蛋白底物，不能与丙烯酰胺有效结合，导致在凝胶背景中，水解条带区分度低、灵敏度低，无法准确的对酶进行定量或定性分析。因此，亟待开发一种准确、灵敏的检测方法，以快速有效的鉴定角蛋白酶资源，加快角蛋白的生物转化，提高角蛋白废弃物的利用率。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法，其包括：

1)角蛋白底物预处理，清除羽毛角蛋白上的杂质；

2)角蛋白胶谱的制备，包括制备分离胶和浓缩胶；

3)进行电泳和水解条带显色；

其中：