[发明专利]一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法

权利要求书

1.一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法，其包括：

1)角蛋白底物预处理，清除羽毛角蛋白上的杂质；

2)角蛋白胶谱的制备，包括制备分离胶和浓缩胶；

3)进行电泳和水解条带显色；

其特征在于：

(A)步骤1)中，将10g角蛋白底物和500ml有机溶剂加入回流冷凝装置中，于80-100℃消煮60-100min；用两倍体积经4℃预冷的丙酮沉淀角蛋白；离心收集角蛋白沉淀，清洗后于4℃晾干，将角蛋白沉淀晾干后，再进行研磨，过100目筛；

(B)在制备分离胶时，加入由(A)处理所得角蛋白底物，使得其质量百分含量为0.1％，然后于室温下以100r/min的速度搅拌1h，离心取上清，进行配置质量浓度为12％的分离胶；配置所述质量浓度为12％的分离胶时，其方法为：依次加入ddH₂O 3.3ml，30％丙烯酰胺溶液4ml，1.5mol/L pH＝8.8的Tris溶液2.5ml，10％SDS 50ul，再加入经(A)处理所得角蛋白底物0.05-0.1g，于室温下以100r/min的速度搅拌1h，然后将溶液在2000g离心15min，取上清，按10ml分离胶中加入10％过硫酸铵100ul以及N,N,N',N'-四甲基二乙胺4ul的体积比例制备成混合溶液；

(C)在电泳时，酶样品按体积比1:3与上样缓冲液混合；按5-10ul/孔混合样品上样，于4℃条件下，进行SDS-PAGE电泳，80-100V恒压跑至分离胶和浓缩胶交界处后改为170-200V恒压，直至溴酚蓝跑出胶外；所述上样缓冲液的成分为：0.32％Tris-HCl 6.4ml，4％pH7.2SDS8ml，16％甘油3.2ml，溴酚蓝0.024g，ddH₂O 2.4ml；

所述角蛋白底物包括羽毛；所述有机溶剂包括二甲基亚砜、乙二醇中的一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用丙酮沉淀角蛋白后，于2000g离心15min收集角蛋白沉淀，用去离子水重悬，清洗沉淀，于2000g离心15min收集沉淀，重复清洗一次后于4℃晾干。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙二醇。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，电泳结束后，将凝胶置于洗脱液中振荡洗脱2次，每次20-40min；然后，用漂洗液漂洗2次，每次10-20min；接着，将凝胶置于孵育液中37℃孵育24-40h；孵育结束后经染色液于室温染色2-4h或于4℃染色过夜；最后，用脱色液A和脱色液B分别脱色0.5-1h和1-2h；

所述脱色液A由甲醇、乙酸、去离子水按体积比3:1:6组成；

所述脱色液B由甲醇、乙酸、去离子水按体积比2:1:8组成。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述洗脱液为：2.5％Triton X-100，50mMTris-HCl，5mM CaCl₂，1μM ZnCl₂，pH7.6；所述漂洗液为：50mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，1μMZnCl₂，pH7.6；所述染色液为：0.05％考马斯亮蓝，甲醇30ml，乙酸10ml，ddH₂O 60ml。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述孵育液为下述孵育液中的一种：

1)50mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，1μM ZnCl₂，0.02％NaN₃，0.05％Brij-35，pH 7.6；

2)0.1M柠檬酸48.5ml，0.2M NaHPO₄ 51.5ml，pH 5.0；

3)50mM Tris-HCl，150mM NaCl，10mM CaCl₂，0.02％NaN₃，pH 7.5。