[发明专利]一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式PCR引物对及检测方法

说明书

本发明公开了一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式引物对及方法。该特异性引物对，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。本检测方法具有较高的灵敏性，符合日常检测的要求。同时，通过本发明的检测引物对可以缩短对甘蔗屈恩柄锈菌进行鉴定的时间，较快地鉴定出甘蔗屈恩柄锈菌，从而克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长等问题。

技术领域

本发明涉及一种植物病害流行监测领域，具体而言，本发明涉及一种用于检测甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的单管巢式PCR引物对、试剂盒及检测方法。

背景技术

由屈恩柄锈菌(P.kuehnii)引起的甘蔗黄锈病是一种世界性的真菌病害[Ryan CC,Egan B T.Rust.//Ricaud C,Egan B T,Gillaspie Jr AG,et al,eds.Diseases ofSugarcane:Major Diseases[M].Amsterdam,the Netherlands:Elsevier,1989:189-210.]。该病曾主要分布在亚洲与澳大利亚[Ryan C C,Egan B T.Rust.//Ricaud C,Egan BT,Gillaspie Jr AG,et al,eds.Diseases of Sugarcane:Major Diseases[M].Amsterdam,the Netherlands:Elsevier,1989:189-210.]，近年来该病已逐渐扩散到美国的弗罗里达州、危地马拉、哥斯达黎加、尼加拉瓜、萨尔瓦多、巴拿马、墨西哥、巴西、古巴、哥伦比亚、多米尼加、厄瓜多尔等国家和地区[Amaresh Chandra,Amber T.Keizerweerd,Michael P.Grisham.Detection of Puccinia kuehnii causing sugarcane orange rustwith a loop-mediated isothermal amplification-based assay[J].Mol Biotechnol,2016,58(3):188-196]。最初认为甘蔗黄锈病所导致的产量不及甘蔗褐锈病，如今随着甘蔗黄锈病的不断扩散，大有赶超之趋势。目前，甘蔗锈病在我国甘蔗种植区广西、云南、广东、福建、四川以及海南等均有发生，且存在复合侵染现象[傅华英，肖胜华，刘营航，等.我国甘蔗锈病病原菌及甘蔗品系抗褐锈病基因Bru1的分子检测[J].热带作物学报，2016，37(5)：958-963]。

针对甘蔗锈菌的检测与鉴定，以往常常依赖常规的形态学并结合传统的鉴别寄主法。该方法需经过病原菌的分离(获得)—形态鉴定—回接与再分离等过程，整个过程中费时费力同时还需要具备专业的分类学知识以及丰富的经验。尽管如此，其结果的准确性和可信度易受外界因素的影响，难以满足快速、高通量鉴定与检测的实际需求。近年来随着分子生物学技术的发展，以PCR技术为代表的分子检测方法得到了迅速地发展和应用。这类方法普遍具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点。目前，已建立了2种甘蔗锈菌特异性常规PCR检测方法[[Glynn NC,Dixon LJ,Castlebury LA,Castlebury LisaA,Comstock Jack.PCR assays for the sugarcane rust pathogens Pucciniamelanocephala and P.Melanocephala and detection of a SNP associated withgeographical distribution in P.kuehnii[J].Plant Pathology,2010,59(4):703-711.]、以及甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)的实时荧光定量PCR分子检测方法。本实验室前期针对甘蔗屈恩柄锈菌(P.kuehnii)设计了传统PCR引物并建立了比较可靠的PCR检测方法。然而，此检测方法仍然存在灵敏度不高，以及可能存在假阳性等问题。所以有必要对甘蔗屈恩柄锈菌的检测与监测技术做进一步的开发与优化。