[发明专利]一种检测甘蔗屈恩柄锈菌的单管巢式PCR引物对及检测方法

权利要求书

1.一组检测甘蔗屈恩柄锈菌（Puccinia kuehnii）的单管巢式引物对，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。

2.一种检测甘蔗屈恩柄锈菌（P. kuehnii）的试剂盒，包括权利要求1所述的单管巢式引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。

4.权利要求1所述的单管巢式引物对以及权利要求2或3所述的试剂盒在检测甘蔗屈恩柄锈菌（P. kuehnii）中的应用。

5.检测甘蔗屈恩柄锈菌（P. kuehnii）的方法，包括下述步骤：

1）提取待测样品DNA；

2）以待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的单管巢式引物对进行PCR扩增；

3）通过肉眼直接观察凝胶电泳检测扩增产物，从而判定样品中是否含有甘蔗屈恩柄锈菌（P. kuehnii）。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

 所述单管巢式PCR扩增的反应体系为20 μL，包括：dd H₂O 13.3 μL，10× rTaq Buffer2 μL，2.5 mM/L d NTPs 1.6 μL，rTaq DNA Polymerase 0.1 μL，含浓度为0.1 pM序列表中序列1所示的核苷酸和浓度为0.1 pM的序列表中序列2所示的核苷酸的溶液1 μL，含浓度为10 μM序列表中序列3所示的核苷酸和浓度为10 µM的序列表中序列4所示的核苷酸的溶液1μL，待测样品DNA 1 μL；

反应程序为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，65℃退火10 s，72℃延伸25 s，20个循环，72℃延伸4 min；94℃预变性3 min，94℃变性30 s，53℃退火10 s，72℃延伸25 s，45个循环，72℃延伸4 min，12℃保存。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：通过将所测样品的单管巢式扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，并在凝胶成像仪下观察结果，如果观察到条带大小与目的条带一致，则所述待测样品含有甘蔗屈恩柄锈菌（P. kuehnii）；反之，则待测样品不含有甘蔗屈恩柄锈菌（P. kuehnii）。