[发明专利]一种新型基因组编辑工具（Lb2Cas12a-RVR）及其构建方法和应用方法

说明书

本发明公开了一种新型基因组编辑工具(Lb2Cas12a‑RVR)及其构建方法和应用方法，其技术方案要点是包括包括编码表达Lb2Cas12a‑RVR突变型蛋白编码质粒pcDNA3.1‑hLb2Cas12a‑RVR，编码蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，该新型改造的基因组编辑工具及其构建方法和应用方法，以解决在精确位点特异性基因编辑的低活性和低保真性的问题，有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选，药物开发，致病突变纠正等进行深入研究，其在人类细胞中具有基因组编辑活性，并且具有更好的的PAM灵活性、高保真度和特殊的切割方式。

技术领域

本发明涉及一种新型基因组编辑工具(Lb2Cas12a-RVR)及其构建方法和应用方法。

背景技术

作为新型的基因组编辑工具，CRISPR家族新成员Cas12a近几年来受到广泛的关注，并在人类细胞以及动植物模型的基因治疗领域崭露头角。Cas12a介导的靶向基因组工程技术已经实现了广泛的研究和医学应用。然而现有的研究多集中于FnCas12a，AsCas12a和LbCas12a，受限于此，哺乳动物相关的基因组编辑研究也多围绕AsCas12a和LbCas12a展开，然而，对于在精确位点特异性的人类基因组编辑中的广泛应用，有限的靶选择谱和低活性、低保真度仍将是其介导应用的瓶颈。因此，迫切需要开发具有用于操纵人类基因组的改进特征的新型Cas12a核酸酶。

此外，细胞基因组在染色体自我复制的过程中由于受到各种内源性或者外源性因素的影响，存在多种形式的损伤，并由此引发一系列细胞学反应。DNA的损伤类型很多，其中以DNA双链断裂(double strand break,DSB)最为严重。且DNA DSB的修复比其他类型的DNA损伤更加困难，不修复则可能导致染色体断裂和细胞死亡，而错误修复则可能导致染色体缺失、重排、转位和倒置等。DNA损伤的不完全修复可导致基因组不稳定，机体细胞为了对抗损伤，进化出多个修复系统来确保基因组的完整性，其中同源重组修复(homologousrecombination repair,HDR)是DNA DSB损伤修复的主要方式。HDR主要发生在有丝分裂的S期和G2监测点，因DNA DSB而导致断裂DNA末端与姐妹染色单体进行结合并进行修复。

基于申请者之前的研究(Tu,M.et al.A'new lease of life':FnCpf1 possessesDNAcleavage activity for genome editing in human cells.Nucleic acidsresearch.2017；45(19):11295-304)，申请者高度怀疑三个Cas12a同源蛋白(Lb2Cas12a，PcCas12a和PmCas12a)具有基因组编辑活性，尽管最初的研究(Zetsche B.et al.Cpf1 isa single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.Cell.2015；163(3):759-71))将它们排除在现有的被广泛接受的基因组编辑工具之外。因此，将其开发为更高效的人类基因组编辑工具，能够极大地扩充申请者对基因编辑器的应用，Lb2Cas12a及突变体在基础研究、临床治疗、微生物育种、植物育种等具有广拓的应用，尤其是为临床疾病治疗提供强有力的研究工具。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种新型改造的基因组编辑工具及其构建方法和应用方法，该新型改造的基因组编辑工具及其构建方法和应用方法，以解决在精确位点特异性基因编辑的低活性和低保真性的问题，有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选，药物开发，致病突变纠正等进行深入研究。其在人类细胞中具有基因组编辑活性，并且具有更好的的PAM灵活性、高保真度和特殊的切割方式。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种新型改造的基因组编辑工具，包括编码表达Lb2Cas12a-RVR突变型蛋白编码质粒pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR，编码蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

一种基因编辑工具的构建方法，包括以下步骤：