[发明专利]一种新型基因组编辑工具（Lb2Cas12a-RVR）及其构建方法和应用方法在审
| 申请号： | 202010042406.1 | 申请日： | 2020-01-15 |
| 公开（公告）号： | CN111647618A | 公开（公告）日： | 2020-09-11 |
| 发明（设计）人： | 谷峰;刘潇宇;林莉 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/79 | 分类号： | C12N15/79;C12N15/66 |
| 代理公司： | 杭州斯可睿专利事务所有限公司 33241 | 代理人： | 孙晓林 |
| 地址： | 325000 *** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 新型 基因组 编辑 工具 lb2cas12a rvr 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种新型基因组编辑工具(Lb2Cas12a-RVR)，其特征在于：包括编码表达Lb2Cas12a-RVR突变型蛋白编码质粒pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR，编码蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的基因编辑工具(Lb2Cas12a-RVR)的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤21：包括引物，所述引物上设置相应突变，所述引物序列如SEQ ID NO.7所示；
步骤22：从pY011(pcDNA3.1-hLb2Cpf1)载体上扩增片段1，序列如SEQ ID NO.2，扩增片段2，序列如SEQ ID NO.3；
步骤23：将扩增后的片段与骨架通过ClonExpressIIOne Step Cloning Kit得到突变后载体pcDNA3.1-hLb2Cas12a-RVR。
3.一种权利要求1所述的一种新型基因组编辑工具(Lb2Cas12a-RVR)的应用方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤33：包括构建针对某致病基因DNA靶点的crRNA，在真核细胞中共引入crRNA和Lb2Cas12a-RVR表达载体，使其在靶位点发生原位修复；
步骤34：构建评估Lb2Cas12a-RVR编辑活性、效率和保真性的GFP报告系统，其利用的GFP基因序列为SEQ ID NO.4；
步骤35：构建Lb2Cas12a-RVR基因修复模板RS1-GFP细胞系，其利用的RS1-GFP基因序列为SEQ ID NO.5；
步骤36：对于处理后的真核细胞基因组DNA进行抽提，然后利用针对靶点的特异性引物进行PCR扩增，利用基因组DNA的PCR产物构建高通量测序DNA文库，并进行高通量测序。
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