[发明专利]一种基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法

说明书

本发明公开了一种基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，属于核酸测序鉴定方法技术领域。它包括以下步骤：(1)提取样品中的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用16S rDNA序列扩增的通用引物，在PCR反应试剂盒中进行PCR扩增反应；(3)分析PCR扩增产物。本发明提供一种适用范围广、通量高、检出阳性率高而且成本低的细菌基因组粗提方法，用于PCR扩增细菌16S rDNA，然后进行测序、鉴定菌种，整个操作快速、简便，且对设备要求低，可扩增细菌16s rDNA全长序列，能够覆盖革兰氏阳性菌和阴性菌，且鉴定成功率高，并对菌种的量要求不高，此外通量高，可同时处理多达几百个样品。

技术领域

本发明属于核酸测序鉴定方法技术领域，具体地说，涉及一种基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法。

背景技术

16S rDNA鉴定是指用利用细菌16S rDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定，是一种快速获得细菌种属信息的方法。它包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。

细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

在16S rRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。16S rDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。

目前，《美国药典》(USP 401113)、《欧洲药典》(EP 9.05.1.6)、《日本药典》(JP17General Information G4)、《中国药典》(通则9204)中均收载了分子生物学技术用于药品微生物质量控制的相关章节。以16S rRNA核酸测序技术为基础的微生物鉴定方法已经建立，并应用于临床分离菌株的研究，但其用于药品质量控制及药品生产环境中常见污染菌的鉴定还鲜有报道；以16S rRNA核酸测序方法进行微生物鉴定的文献中，所选取的测序靶点和测序引物各异，符合药品质量控制要求的具有鉴定和分类意义的DNA特征序列片段尚不清晰明确；现有研究中的核酸测序结果多数是通过Blast分析法与Genebank数据库中的核酸序列进行比对，对于测序结果的质量核查和Genebank数据库中序列信息的准确性关注度较小，测序结果的判定依据尚不规范统一。

此外，目前市面上已经有很多商业化的试剂盒，一些文献也报道过碱裂解法用于提取细菌的基因组，还有一些实验室广泛使用的水煮法粗提取细菌的基因组用于后续的16S rDNA PCR扩增，测序进行菌种鉴定。具体如下：

1)试剂盒提取细菌基因组的缺点：成本高，通量小，提取时间长；

2)文献中报道的一些碱裂解法提取的细菌基因组PCR扩增的方法，步骤也不够简便，适用范围也具有局限性；

3)常规水煮方法难以有效破坏革兰氏阳性菌细胞壁，使得基因组DNA提取效率极低，无法用于PCR法检测。

发明内容

1、要解决的问题