[发明专利]一种CAR-T培养基及其应用

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种培养基及其应用。该培养基包括IL‑2、IL‑7、IL‑15、B27、自体血浆和X‑vivo 15培养基。本发明培养基在培养meso CAR‑T细胞时，能够提高细胞的扩增倍数，延长细胞培养天数，保证更多的记忆性T细胞，并能够维持表达meso CAR等表面标志物表达。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别设计一种CAR-T培养基及其应用。

背景技术

间皮素(MSLN)是一种通过磷脂酰肌醇区(GPI)锚定在细胞膜上得糖蛋白。它最初合成的是一个69kDa的细胞表面蛋白。成熟过程中在弗林蛋白酶的作用下断裂成两段，C末端40kDa的片段锚定在膜上，N末端32kDa的片段以溶解的形式释放出来，称为巨核细胞增效因子(MPF)。MSLN在腹膜、胸膜腔和心包上的间皮细胞上表达，而在上气管、卵巢、睾丸网、扁桃体和输卵管的上皮细胞表面低表达。此外，MSLN被发现在间皮瘤、卵巢癌和肺癌等恶性肿瘤中高表达。

随着肿瘤免疫学理论和技术的发展,免疫细胞在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。过继性细胞免疫治疗是近年来备受关注的恶性肿瘤的治疗策略之一。其中,嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)T细胞技术是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。通过基因改造技术,效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高,并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。CAR由胞外区、跨膜区和胞内区三个部分组成，其本质上是由不同蛋白功能结构域串联形成的膜蛋白。胞外区通常是分离自抗原特异性单克隆抗体的scFv片段，胞内是T细胞活化的分子，如CD3ζ、FcRγ、CD28或者41BB。第一代CAR只有一个胞内信号组份，主要是CD3ζ或FcRγ，T细胞可以被活化但无法增殖。第二代CAR具有两个胞内信号组份，包括一个共刺激分子，如CD28、41BB等。第三代CAR具有三个胞内信号域，包括两个串联的共刺激域CD28、41BB或OX40和一个CD3ζ。第4代CAR(4SCART)是在原有的CAR结构上加入自杀基因的可调控元件增加安全性与靶向性，或者加入调控IL-12分泌的元件，以解除体内免疫抑制微环境。

目前正在开发针对恶性肿瘤的CAR种类很多，主要包括利用抗间皮素、抗CD19、抗BCMA、抗CD22、抗GPC3等抗体构建CAR修饰的T细胞等免疫细胞进行抗肿瘤研究，其中靶向间皮素分子的嵌合抗原受体基因修饰的T细胞(meso CAR-T)在治疗晚期卵巢癌、胰腺癌等实体肿瘤非常具有应用前景。美国宾夕法尼亚大学的研究小组的临床试验结果显示，六名复发性浆液性卵巢癌患者注射表达二代CAR的meso CAR-T细胞治疗后，没有观察到与输注相关的急性不良事件(AE)和细胞因子释放综合症。一名患者观察到相关的3-4级AE，包括胸腔积液，呼吸急促和呼吸困难；2例患者伴有腹痛，腹水和便秘。在治疗一个月后，所有六名患者在按照RECIST标准成像时显示病情稳定(SD)[Gregory L.，et al.Activity ofMesothelin-specific Chimeric Antigen Receptor T cells Against PancreaticCarcinoma Metastases in a Phase 1Trial.Gastroenterology,2018.]

CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，传统采用IL-2+RPMI1640+FBS培养基培养CAR-T细胞，但采用IL-2+RPMI1640+FBS去培养转染慢病毒后的T细胞存在诸多缺点：

1.转染后CAR-T细胞无法大量增殖，且易出现CAR丢失的现象，导致长期培养后T细胞表面的CAR分子逐渐丢失，以转染meso CAR的T细胞为例，即使转染效率达到70％以上，通常培养10天后meso CAR表达的细胞比例会下降至20％左右；

2.培养时间有限，导致CAR-T细胞无法达到回输数量