[发明专利]一种嵌合抗原受体-单核/巨噬细胞(CAR-M)的构建及其应用

说明书

本发明涉及一种嵌合抗原受体‑单核/巨噬细胞(CAR‑M)的构建及其应用。运用基因编辑手段设计、优化适于导入单核/巨噬细胞细胞膜组构的基因工程受体分子作为嵌合抗原受体，包括前导肽，识别区，铰链区和跨膜/胞内信号区，具体地，所述嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.18所示的序列。本发明还涉及上述嵌合抗原受体‑单核/巨噬细胞(CAR‑M)的应用，本发明采用单核/巨噬细胞作为细胞免疫治疗的载体细胞，是利用其良好的组织浸润性与细胞因子趋化性，可以解决CAR‑T无法进入实体瘤内部的问题。本发明利用嵌合抗原受体赋予单核/巨噬细胞对肿瘤细胞的靶向性，并增强对肿瘤细胞的吞噬，进一步可以递呈肿瘤抗原给T细胞，增强抗肿瘤免疫。本发明所构建的嵌合抗原受体‑单核/巨噬细胞(CAR‑M)可用于肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等实体瘤的细胞免疫治疗。

技术领域：

本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及嵌合抗原受体-单核/巨噬细胞(CAR-M)的构建及其应用。

背景技术：

目前国际上用于细胞免疫治疗的细胞主要分为两大类：第一类包括淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、自然杀伤细胞(NK)及细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)等；第二类是具有肿瘤抗原特异性的T淋巴细胞，包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T细胞(CTL)。其中第一类技术体系较为简单，尤其是CIK细胞的治疗在我国较为流行，第二类的技术体系相对复杂，细胞培养周期较长，培养的成功率相对较低，但由于对杀伤肿瘤细胞具有高度的特异性，因此疗效更为明显。CAR-T是基于以上两类研究获得的新的治疗细胞，CAR是Chimericantigen receptor(嵌合抗原受体)的缩写，CAR-T细胞免疫治疗是将患者的T细胞通过基因工程修饰，加上一个嵌合抗原受体，然后经过体外扩增再回输至病人体内。在急性白血病、非霍奇金淋巴瘤等血液系统肿瘤的治疗上，CAR-T细胞已取得显著的疗效。然而CAR-T细胞免疫治疗在实体瘤临床治疗过程中遭遇了前所未有的挑战：1)实体瘤细胞外基质阻碍了CAR-T细胞浸润；2)实体瘤免疫抑制微环境(大量浸润的免疫抑制细胞，Treg、TAMs、MDSC等；免疫抑制细胞因子，TGF-β、IL-10等；抑制蛋白的表达，PD-1/PD-L1、CTLA-4等)抑制CAR-T肿瘤杀伤活性；3)实体瘤高度异质性使得CAR-T细胞疗法缺乏有效的肿瘤抗原。

巨噬细胞具有强大的吞噬功能，每天可以清除大约2×10¹¹个红细胞，相当于每年机体可以循环利用3kg的血红蛋白。另外，巨噬细胞在吞噬、抗原递呈、免疫平衡调节等方面发挥重要作用，对维持机体的免疫稳态发挥重要的监视功能。巨噬细胞通过表面受体能够侦查出周围环境中的组织损伤信号或微生物入侵信号，一旦发现异常，即可诱导出巨噬细胞的吞噬作用和抗原递呈作用，促进机体的特异性免疫反应。例如肺泡巨噬细胞能有效清除肺部的过敏原；肝巨噬细胞(Kupffer细胞)能帮助清除血液中循环的病原体和毒素。巨噬细胞还能吞噬免疫原性死亡的肿瘤细胞并递呈肿瘤抗原给T细胞，发挥抗肿瘤免疫作用。

然而，近年来研究发现，肿瘤组织中的肿瘤细胞或其他细胞通过释放CCL2、CXCL12、 CSF1等趋化因子招募巨噬细胞浸润，在实体瘤微环境中巨噬细胞是浸润比例最高的免疫细胞。肿瘤组织中浸润的巨噬细胞又称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor associatedmacrophages， TAMs)，在肿瘤的发生、发展、转移中发挥重要作用。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞可通过CD47、 MHCI分子与巨噬细胞上的受体结合，抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。同时，调控TAMs 中的脂质代谢，促进脂滴堆积，导致巨噬细胞的吞噬能力受损。因此，肿瘤组织中浸润的巨噬细胞虽然具备杀伤肿瘤细胞的潜能，却由于肿瘤细胞表面CD47等分子的抑制作用，导致 TAMs不仅不杀死肿瘤细胞，还可以通过促进血管增生等作用，促进肿瘤的生长。

基于此，我们将单核/巨噬细胞作为细胞免疫治疗的载体细胞，结合目前嵌合抗原受体技术蓬勃发展的优势与日渐成熟的基因优化技术，从分子水平上改造单核/巨噬细胞，制备获得嵌合抗原受体-巨噬细胞(CAR-M)，利用其高效浸润性，增强其吞噬能力及抗原递呈能力，使CAR-M有望成为细胞免疫治疗的新一代主角。

发明内容