[发明专利]一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法

说明书

本发明公开了一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞的分离方法。本发明能够快速、高效地从鲫外周血中分离大量的高纯度白细胞，分离步骤包括血液富集、红细胞去除和白细胞富集等。本发明克服了现有白细胞分离技术存在的操作复杂、分离的白细胞不纯、状态不佳的问题。本发明能够快速、高效地分离和获得纯度高且状态好的鲫鱼外周血白细胞，为以后研究鲫白细胞形态特征和免疫机能提供帮助。

技术领域

本发明属于白细胞的分离技术领域，具体涉及一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法。

背景技术

淇河鲫（Carassius auratus）俗称“双背鲫”，是天然的三倍体鱼类，具有独特的生物学特性，是经济价值较高的鲫鱼地方亚种，其肉质鲜美具有较高的营养价值。淇河鲫是河南鹤壁市“淇河三珍”之一，也是全国农产品地理标志，成为河南省重点推广的名特优鱼类，养殖密度和面积不断增加。但是随着养殖密度提高，淇河鲫不断受到各种病害的侵袭，在这种形势下，亟需开展淇河鲫免疫防病的基础研究。

白细胞是鱼类免疫系统的重要组成部分，也是连接鱼类细胞免疫和体液免疫的关键桥梁，在鱼类免疫调节和疾病防御中发挥重要作用。鱼类白血细胞包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、浆细胞和巨噬细胞等，并且鱼类白细胞已具有类似T、B淋巴细胞的分类，能被抗原所激活并产生相应的抗体和免疫因子。近年来，离体培养的白细胞在水产动物免疫学、水产动物病原学、鱼类生理学和水产药物学等多个学科领域内被研究应用。因此，建立成熟的鱼类外周血白细胞分离方法，获得足够数量、高纯度的鱼类白细胞对免疫学相关研究至关重要。

虽然，目前有一些关于鱼类白细胞的提取方法，然而，由于鱼类是低等脊椎动物，血细胞的组成和血液指数在不同物种间具有较大差异，鱼类外周血白细胞分离方法目前没有统一的标准。并且，已经建立的各种鱼类白细胞分离方法都具有不同程度的差异，没有形成一套成熟的分离方法。另外，关于鲫外周血白细胞的研究主要集中在其形态方面，关于外周血白细胞分离技术的研究尚未见报道。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法，其特征在于具体过程为：

步骤S1：用酒精棉擦拭鲫鱼尾部消毒，使用含有5-6mL预冷抗凝剂的注射器从鲫鱼尾静脉抽取1mL血液，其中抗凝剂为含3-5g/mL BSA和15-20IU/mL Heparin的1640细胞培养基，配制好后于4℃预冷；

步骤S2：将步骤S1得到的稀释血液在4℃、50-150g离心条件下水平离心10-20min，离心结束后用移液枪将上清移至干净离心管中；

步骤S3：使用无菌胎牛血清润洗10mL无菌离心管，润洗后的离心管在试管架上静置1-3min，使用移液枪去除管底多余胎牛血清，向试管中加入3-5mL 1.080-1.085g/mL的percoll分离液；

步骤S4：取3-5mL步骤S2中得到的上清加至步骤S3中制备的percoll分离液上方，在4℃，800-900g离心条件下水平离心20-30min，使用1mL注射器从中间层吸取白细胞溶液，将白细胞溶液置于1.5mL无菌离心管，再加入等体积的磷酸盐缓冲液，然后在500-600g离心条件下离心5-10min，由此富集到高纯度的鲫鱼外周血白细胞。

进一步优选，步骤S3中所述percoll分离液是由1.130g/mL percoll母液、1.5mol/L NaCl溶液和H₂O配制而成的比重为1.080-1.085g/mL的percoll分离液。

进一步优选，步骤S1中所述鲫鱼为淇河鲫。