[发明专利]四种梨病毒病病原实时荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明涉及四种梨病毒病病原实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank公布的苹果茎沟病毒、苹果茎痘病毒、苹果褪绿叶斑病毒的CP基因和苹果锈果类病毒的全基因组的保守序列设计引物，建立了SYBR Green荧光定量PCR检测这四种病毒和进行阴阳性判断的方法。本发明的方法具有特异性强，检测准确，重复性好且成本低廉等特点。相比常规的逆转录聚合酶链式扩增反应检测技术，检测灵敏度提高100倍以上。

技术领域

本发明涉及苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)四种梨病毒病病原物的实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

梨树病毒病是果树长势变弱和果实产量锐减的主要原因之一，我国主要梨产区的果树平均带毒率达86.3％，主要病毒病病原包括苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)四种，对梨生产造成严重影响。

梨病毒病病原检测方法主要为RT-PCR方法，此种方法无法对病毒进行定量检测。与RT-PCR方法相比，实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法能够更精准、简便而且能定量地对病毒经行检测。实时荧光定量PCR分为染料法和探针法，探针法需要设计荧光标记的探针，价格昂贵，因此不利于大量样品的检测。本发明采用SYBR Green染料法，兼具实时荧光定量PCR方法准确定量和价格便宜的特点，适合大量样品的检测，为梨树病毒病发生情况提供判断依据，具有病毒防治、生产无毒苗方面都具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供四种梨树的主要病毒病病原的定量检测方法。

本发明针对感染梨的苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)四种主要病毒，根据NCBI上公布的苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)的保守区域序列进行引物设计，建立了SYBR Green荧光定量PCR检测苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)和进行阴阳性判断的方法，实现了对这四种病毒的定量检测。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

四种侵染梨的病毒——苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果锈果类病毒(ASSVd)的实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)、设计苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)的SYBR Green I荧光定量PCR引物；

(2)、进行引物筛选，并根据筛选出的引物在不同退火温度下进行PCR扩增以确认最适反应条件；

(3)、标准曲线的构建

依据步骤(2)所筛选出的引物，以苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的CP基因和苹果锈果类病毒(ASSVd)的全基因组cDNA为模板，进行实时荧光定量扩增，绘制荧光定量标准曲线；

(4)、实验成立标准

每次实验设立阳性和阴性对照。若阴性对照品无Ct值，且无规则扩增曲线，同时阳性对照品Ct值小于35.0，且扩增曲线和熔解曲线正常，则是实验成立。若阴性和阳性对照不满足上述条件，此次实验视为无效。

(5)、阴性与阳性判断标准