[发明专利]四种梨病毒病病原实时荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.四种侵染梨的病毒——苹果茎沟病毒、苹果茎痘病毒、苹果褪绿叶斑病毒和苹果锈果类病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、设计苹果茎沟病毒、苹果茎痘病毒、苹果褪绿叶斑病毒、苹果锈果类病毒的SYBRGreen I荧光定量PCR引物；

(2)、进行引物筛选，并根据筛选出的引物在不同退火温度下进行PCR扩增以确认最适反应条件；

(3)、标准曲线的构建

依据步骤(2)所筛选出的引物，以苹果茎沟病毒、苹果茎痘病毒、苹果褪绿叶斑病毒的CP基因和苹果锈果类病毒的全基因组cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，绘制荧光定量标准曲线；

(4)、实验成立标准

每次实验设立阳性和阴性对照；若阴性对照品无Ct值，且无规则扩增曲线，同时阳性对照品Ct值小于35.0，且扩增曲线和熔解曲线正常，则是实验成立；若阴性和阳性对照不满足上述条件，此次实验视为无效；

(5)、阴性与阳性判断标准

在实验成立的情况下，若待测样品的Ct值小于35.0，且扩增曲线和熔解曲线与阳性对照相似，则判断为阳性；待测样品无Ct值或者大于35并且扩增曲线和熔解曲线与阳性对照不同，则判断为阴性。

2.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤(1)中依据苹果茎沟病毒、苹果茎痘病毒和苹果褪绿叶斑病毒CP基因序列以及苹果锈果类病毒的全基因组序列，通过Bioedit软件进行序列比对，确定基因序列的保守区域，根据保守区域使用PrimerPremier 6软件设计荧光定量引物；

各病毒检测引物名称如下：

苹果茎沟病毒检测引物：上游引物：ASGV-F；下游引物：ASGV-R；

苹果茎痘病毒检测引物：上游引物：ASPV-F；下游引物：ASPV-R；

苹果褪绿叶斑病毒检测引物：上游引物：ACLSV-F；下游引物：ACLSV-R；

苹果锈果类病毒检测引物：上游引物：ASSVd-F；下游引物：ASSVd-R；

引物序列如下：

ASGV-F：5’CCACTTCTAGGCAGAACTCTTTGAACGA 3’；

ASGV-R：5’TGAAGAAATTCACGAGCCAAATCAGCAA 3’；

ASPV-F：5’GAGAGAGTAGCCAATGCCACGAGCAA 3’；

ASPV-R：5’CACCAAAATTCACAGCTTGGGTACC 3’；

ACLSV-F：5’TGAGAGGCTCTATTCACATCTTG 3’；

ACLSV-R：5’CAATTGGAATATCCCCTTCTGCGAT 3’；

ASSVd-F：5’TCGACGAAGGCCGGTGAGAAAGGAG 3’；

ASSVd-R：5’TTGTAGGCGAACCCACAGCGGAACT 3’。

3.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤(2)中以各个病毒的阳性对照为模板，使用不同引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳检测扩增特异性和扩增效率，同时在不同温度下进行退火步骤，筛选出特异性强，扩增效率高的引物，并确定最佳退火温度为58℃。

4.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤(2)中PCR反应程序为：95℃2min；95℃30s，53-63℃30s，72℃30s，×40循环；72℃10min；4℃10min。

5.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR反应使用ABI 7500 System荧光定量PCR仪，反应程序为：95℃5min；95℃5s，58℃15s，72℃20s，40个循环，72℃采集荧光信号。

6.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：阳性对照选择RT-PCR检测为阳性的梨cDNA模板，阴性对照选择健康无病毒的梨cDNA模板；

若判定为阳性，则表明样品中含有待测病毒；若判定为阴性，则表明样品中不含有待测病毒。