[发明专利]细胞和生物分子上的直接寡核苷酸合成

权利要求书

1.一种在存活细胞上合成具有预定序列的寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供具有游离3’-羟基的起始子，所述起始子被附接至所述细胞的细胞表面分子或被锚定在所述细胞的细胞表面膜中；

b)在生物条件下重复以下步骤的多于一个循环：(i)使具有游离3’-O-羟基的所述起始子或延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得所述起始子或延长的片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长以形成3’-O-封闭的延长的片段，和(ii)使所述延长的片段去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的片段，从而合成预定序列的寡核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述3’-O-封闭的核苷三磷酸是3’-磷酸核苷三磷酸，并且所述去封闭步骤通过用3’-磷酸酶活性处理所述3’-O-封闭的延长的片段来进行。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述3’-磷酸酶活性由T4多核苷酸激酶、重组虾碱性磷酸酶或牛小肠碱性磷酸酶提供。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述3’-O-封闭的核苷三磷酸是3’-酯封闭的核苷三磷酸，并且所述去封闭步骤通过用酯酶活性处理所述3’-O-酯封闭的延长的片段来进行。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物条件包括pH在6.8至7.8的范围内的缓冲生理盐和在15℃至41℃的范围内的温度。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述存活细胞是哺乳动物细胞。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述起始子包括具有共价附接至5’末端的亲脂性锚的寡核苷酸，其中所述亲脂性锚稳定地插入所述存活细胞的细胞表面膜中。

8.一种生成具有细胞特异性寡核苷酸条形码的cDNA文库的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在生物条件下，在细胞群中每个细胞的细胞表面膜上合成独特的寡核苷酸条形码，以形成条形码编码的细胞的群体；

(b)将每个条形码编码的细胞分离到反应器中；

(c)裂解每个反应器中的条形码编码的细胞；

(4)在每个反应器中进行逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)，以产生具有细胞特异性寡核苷酸条形码的cDNA文库。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述合成步骤包括(a)将起始子附接至所述群体的每个所述细胞的所述细胞表面膜上，和(b)重复以下循环：(i)在生物条件下，使具有游离3’-O-羟基的所述起始子或延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得所述起始子或延长的片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长以形成3’-O-封闭的延长的片段，和(ii)使所述延长的片段去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的片段。

10.根据权利要求9所述的方法，其中每个所述循环还包括在将所述细胞的所述群体拆分到单独的反应混合物中，在所述单独的反应混合物中，所述起始子或延长的片段被不同种类的核苷三磷酸延长以形成所述延长的片段，之后将单独的反应混合物的所述细胞组合。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述反应器是油包水乳液的胶束。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述胶束由微流体装置产生。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中来自所述反应器的所述cDNA被组合并通过高通量DNA测序进行分析。