[发明专利]基于核酸的检测方法

说明书

本发明的实施方案涉及检测和/或定量样品中的靶标部分的设备和方法，包括使用基于核酸分子的再捕获事件。具体地但非唯一地，本发明的某些实施方案涉及包括置换固定的核酸分子以形成靶标‑核酸分子复合物并且检测靶标‑核酸复合物或核酸分子本身的随后再捕获事件的设备和测定。本文描述了其他方面和实施方案。

发明的领域

本发明的实施方案涉及检测和/或定量样品中的靶标部分的设备和方法，包括使用基于核酸分子的再捕获事件。具体地但非唯一地，本发明的某些实施方案涉及包括置换固定的核酸分子以形成靶标-核酸分子并且检测靶标-核酸复合物或核酸分子本身的后续再捕获事件的设备和测定。本文描述了其他方面和实施方案。

发明的背景

适体是小的人工配体，包括能够以高亲和力和特异性与感兴趣的特定靶标部分结合的单链DNA、RNA或多肽分子。适体被认为是用作诊断剂和/或治疗剂的抗体的备选物。此外，在环境和食品研究以及临床诊断领域的许多分析应用中，适体也显示出有望作为抗体的替代物。

当前，通过对感兴趣的靶标部分的基于亲和力的分配，反复筛选候选寡核苷酸的部分随机化文库的过程来获得适体。适体在广泛的pH和温度范围内具有高结构稳定性，使其成为广谱体外、体内和离体应用的理想试剂。

1990年，由两个独立小组TuerkGold，1990(Science 249,505-510)和EllingtonSzostak，1990(Nature 346,818-822))开发了模拟进化过程的体外方法，以鉴定高亲和力适体。该过程称为体外选择。该过程利用进化的基本概念，利用变异、选择和复制来从简并核酸分子(即寡核苷酸)的起始库中获得高靶亲和力和特异性。通常，为了选择核酸(DNA或RNA寡核苷酸)适体，通过合成短寡核苷酸(大小范围为约20至约100个核苷酸)的简并文库(约10¹⁴个不同序列)来实现变异。每个寡核苷酸通常包含内部随机区，其两侧是引物区域，用于随后通过合适的扩增反应进行扩增，例如，用于DNA的聚合酶链式反应(PCR)，或用于RNA的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，随后为体外转录反应。

当前的适体选择方法包括在允许核酸分子与靶分子结合的条件下将核酸库与固定的靶分子孵育；然后进行彻底洗涤以去除非结合或低亲和力序列。洗脱结合的核酸分子，并使用PCR或其他扩增方法扩增。然后，扩增的核酸分子形成用于下一轮体外选择的起始原料输入。重复该过程多次，直到富集一种或多种核酸适体，所述核酸适体紧密且特异性地与单个靶分子/多个靶分子结合。制备随机文库和基于亲和力的分配方法的最新技术进步已经产生了对抗体具有同等亲和力的适体。

已经针对多种靶分子提出了适体，所述靶分子包括例如无机组分、有机小分子、蛋白质、肽、核酸、碳水化合物和细胞。因此，适体可用于检测和定量给定样品中特定产物的量。

与抗体相比，适体具有若干优点，例如包括：易于体外合成、灵活修饰、靶标范围宽泛、可重复使用性以及热/化学稳定性高。因此，在许多测定和检测方法中，使用适体代替抗体。在一个实例中，目前在诸如ELISA(酶联免疫吸附测定)的测定中使用适体代替抗体。当使用适体代替抗体时，所得测定通常称为“ELONA”(酶联寡核苷酸测定)，“ELASA”(酶联适体吸附测定)，“ELAA”(酶联适体测定)或类似测定。将适体掺入这些ELISA样测定平台中可以提高灵敏度，使得可以检测更多数量的分析物；包括没有可用抗体和更宽范围的输出的分析物，因为适体可以与多个报告分子(包括荧光团和淬灭分子)缀合。与使用抗体有关的其他缺点包括，例如不适当的聚集和与抗体的标记和/或产生有关的并发症。

也已经将适体用于许多其他测定形式，例如侧向流动装置、生物传感器和类似的测定形式。然而，仍然需要提供具有良好灵敏度和准确性的掺入适体的测定。

本发明的实施方案旨在克服与现有技术有关的问题。

发明的一些实施例方案的总结