[发明专利]产生病毒的方法和组合物

说明书

本发明涉及一种用于产生用作疫苗的重组腺病毒的方法，该重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列，该方法包括以下步骤：通过将末端蛋白复合腺病毒基因组DNA(TPC‑Ad gDNA)与多核苷酸重组，将异源目的基因插入腺病毒基因组，该多核苷酸包含编码目的基因的核苷酸序列，并所述核苷酸序列的5’末端和3’末端与在体外重组反应中腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源；用来自(i)的体外重组反应混合物的稀释液转染在单个容器中生长的细胞，使得许多这样的单个容器包含被重组腺病毒感染的单个细胞，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列；鉴定其中单个细胞已被重组腺病毒感染的那些个容器，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列。适当地，所述TPC‑Ad gDNA包含血清型匹配的末端蛋白和腺病毒基因组，所述目的基因编码单个表位、表位串、抗原区段或完整抗原蛋白。本发明还涉及使用这些方法制备的重组腺病毒和组合物。

技术领域

本发明涉及重组腺病毒的快速产生，用于诱导针对异源抗原的免疫应答，适当地为保护性免疫应答，所述异源抗原包括感染性病原体抗原和与癌症有关的肿瘤抗原。

背景技术

源自血清5型人腺病毒(HAdV-C5)或其他人类腺病毒或猿猴腺病毒的复制能力不强的腺病毒载体已被用作疫苗载体，以在多个临床试验中传递感染性病原体抗原和癌症抗原(Ewer et al.(2017)Hum Vaccin Immunother.13(12):3020-3032和Cappuccini et al.(2016)Cancer Immunol Immunother.65(6):701-13.)。这些载体为疫苗开发提供了许多优势。它们在人中不具有复制能力，因此比复制载体更安全；它们感染复制和非复制细胞；它们具有广泛的组织嗜性，可引起高免疫反应，包括特别有效的细胞免疫；而且它们很容易纯化至高滴度(Morris et al.(2016)Future Virology 11(9),649-659)。结合λ噬菌体Red重组(重组工程)的细菌人工染色体(BAC)技术的出现促进了腺病毒基因组的克隆和操作(Ruzsics Z.,Lemnitzer F.,Thirion C.(2014)Engineering Adenovirus Genome byBacterial Artificial Chromosome(BAC)Technology.In:Chillón M.,Bosch A.(eds)Adenovirus.Methods in Molecular Biology(Methods and Protocols),vol1089.Humana Press,Totowa,NJ)。该技术与重组技术相结合，用于快速插入表达盒，目前用于产生腺病毒载体。但是，使用这种方法和传统的制造过程，从抗原鉴定到临床级腺病毒载体的平均时间为33-44周(图1)。制备用作疫苗的重组病毒涉及在GMP之前(药品生产质量管理规范之前)产生的起始物料，所述起始物料需要在最初感染受纳细胞后将其拯救(rescue)后才能克隆该重组病毒。这是一个耗时的过程，由于可能需要将氯霉素基因(用于标准腺病毒基因组操作过程中用于细菌人工染色体(BAC)选择)插入到腺病毒基因组中，以及从BAC衍生的腺病毒基因组产生的病毒载体是异质性的，因此最多需要进行3轮克隆，每轮克隆需要5周。使用BAC时，在细菌操作过程中可能在腺基因组中引入的任何突变都将被带入腺病毒。在本发明的方法中解决了该问题，其中在开始产生重组腺病毒之前已经克隆并表征了腺病毒基因组DNA，因而已知是正确的。因此，没有必要对腺病毒基因组DNA进行测序，就像之前已经描述过的那样。

Hillgenberg及其合作者(Journal of Virology 80(11)(2006)5435-5450)和另外的Choi及其合作者(Journal of Biotechnology 162(2012)246-252)已描述了使用重组手段用于生成大量重组腺病毒的快速方法，不再需要穿梭载体构建、细菌转化和选择，并减少了噬斑分离所需的精力。然而，这些作者试图产生表达大量不同异源基因的重组腺病毒种群，并且在其用作疫苗的方法中未能提供对单个重组病毒的快速且简单的克隆。根据与此类疫苗的GMP生产和临床使用相关的法规，腺病毒疫苗的临床使用需要单个克隆。