[发明专利]核酸检测方法

权利要求书

1.一种用于检测样品中具有确定序列的单链靶核酸的存在的方法，其包括：

a)使样品与以下接触：

i.第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，其中该第一引物在5'至3'方向上包含具有限制酶识别序列和切割位点以及能够与靶核酸中的第一杂交序列杂交的区域的一条链，并且该第二引物在5'至3'方向上包含具有限制酶识别序列和切割位点以及能够与靶核酸中第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域的一条链；

ii.链置换DNA聚合酶；

iii.dNTP；

iv.一种或多种修饰dNTP；

v.第一限制酶，其不是切口酶，但在第一引物的识别序列和切割位点为双链时能够识别第一引物的识别序列，并仅切割具有该切割位点的该第一引物链，而反向互补链的切割因一种或多种修饰的存在而被阻断，其中所述一种或多种修饰通过所述DNA聚合酶使用一种或多种修饰dNTP而掺入到所述反向互补链中；和

vi.第二限制酶，其不是切口酶，但在第二引物的识别序列和切割位点为双链时能够识别第二引物的识别序列，并仅切割具有该切割位点的该第二引物链，而反向互补链的切割因一种或多种修饰的存在而被阻断，其中所述一种或多种修饰通过所述DNA聚合酶使用一种或多种修饰dNTP而掺入到所述反向互补链中；

以不经温度循环在该靶核酸的存在下产生扩增产物；

b)使步骤a)的扩增产物与以下接触：

i.第一寡核苷酸探针，所述第一探针能够与扩增产物中的至少一个分子种类中的第一单链检测序列杂交，并且所述第一探针附着在允许其检测的部分上；和

ii.第二寡核苷酸探针，所述第二探针能够与扩增产物中的该至少一个分子种类中的该第一单链检测序列上游或下游的第二单链检测序列杂交，并且所述第二探针附着在固体材料上或附着在允许其附着到固体材料的部分上；

其中第一和第二探针与扩增产物中的该至少一个分子种类的杂交产生检测物种类；和

c)检测在步骤b)中产生的检测物种类的存在，其中检测物种类的存在指示该样品中存在靶核酸。

2.权利要求1的方法，其中该第一和第二寡核苷酸探针之一在3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被该第一或第二限制酶切割。

3.权利要求2的方法，其中由于存在一个或多个序列错配和/或一个或多个修饰如硫代磷酸酯键，使得该封闭的寡核苷酸探针不能被第一或第二限制酶切割。

4.权利要求2或3的方法，其中该封闭的寡核苷酸探针在步骤a)进行的同时与样品接触。

5.权利要求2至4中任一项的方法，其中该封闭的寡核苷酸探针包含附加区域，使得与该封闭寡核苷酸探针杂交的扩增产物内的该分子种类的3'端可通过链置换DNA聚合酶延伸。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中样品在步骤a)中还与以下接触：(A)第三寡核苷酸引物，该第三寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含具有第一限制酶的识别序列和切割位点以及能够与靶核酸中的第一杂交序列杂交的区域的一条链，其中该第三引物在3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸；和/或(B)第四寡核苷酸引物，该第四寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含具有第二限制酶的识别序列和切割位点以及能够与靶序列中的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域的一条链，其中该第四引物在3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸。

7.权利要求5的方法，其中第三寡核苷酸引物在存在时以超过第一寡核苷酸引物的量提供，并且第四寡核苷酸引物在存在时以超过第二寡核苷酸引物的量提供。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中该一种或多种修饰dNTP是α-巯基修饰的dNTP。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中该第一和第二限制酶是相同限制酶。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤a)、b)和c)中的两步或更多步同时进行。