[发明专利]用于DNA、特别是细胞游离DNA的表观遗传学分析的方法

说明书

提供了用于使用有机硼烷将细胞游离DNA中的氧化的5‑甲基胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶(DHU)残基的细胞游离DNA的表观遗传学分析方法。使细胞游离DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷经选择以成功地引起氧化的5‑甲基胞嘧啶残基(例如5‑羧甲基胞嘧啶和5‑甲酰基胞嘧啶)的还原、脱氨基和脱羧基，从而代替其产生DHU残基。扩增后，对经处理的细胞游离DNA进行测序，DHU残基读取为胸腺嘧啶残基。还提供了反应混合物、试剂盒和另外的方法，以及用于DNA(包括细胞游离DNA)的表观遗传学分析的相关方法。

技术领域

本发明总体上涉及生物技术，并且更特别地涉及细胞游离DNA的表观遗传学分析。本发明的发现可用于基因组学、医学、诊断学和表观遗传学研究领域。

背景技术

表观遗传学领域要求检测某些DNA修饰，特别是经修饰的胞嘧啶残基5-甲基胞嘧啶(5mC)及其主要氧化产物5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)：

最初，研究人员专注于5mC，因为直到后来5hmC才被鉴定为潜在的重要修饰。为了在单碱基分辨率下区分未经修饰的胞嘧啶残基和5mC残基，DNA表观遗传学分析通常需要使用亚硫酸氢盐试剂，只要亚硫酸氢盐通过方案1的方法迅速将胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基。

方案1:

然而如方案2所示，在5mC的情况下表现出非常低的转化率。

方案2:

然而，在单碱基分辨率分辨率测序中使用亚硫酸氢盐有两个严重的缺点。首先，亚硫酸氢盐导致DNA显著降解，高达90％或更高。这妨碍了使用非常少量的DNA来实施该技术，例如在细胞游离DNA的情况下，因为细胞游离DNA每mL血浆通常仅包含几纳克DNA。第二，亚硫酸氢盐方法假定胞嘧啶完全转化为胸腺嘧啶，使亚硫酸氢盐过程容易出现假阳性，甚至1％的非转化率也导致10％-15％或更高的假阳性读数。依赖于完全转化还导致引物设计困难、测序读取的低定位速率及测序成本的总体增加。

随着表观遗传学领域的发展，另一种DNA修饰5hmC的检测被证明潜在地与5mC的检测一样重要。虽然5mC修饰通常发生在CpG二核苷酸内，但是天然5hmC残基倾向于出现在其他位置。此外，根据组织类型，5hMC的发生频率比5mC的发生频率要低得多，比率通常为约10:1(参见Nestor等(2012)Genome Biology 13:R84)，其中5mC代表所有DNA碱基的约1％。尽管已经确定5hmC参与多种过程，包括转录、DNA脱甲基化，和在5hmC模式异常的情况下参与肿瘤发生，但是5hmC的分子功能才开始被了解。参见Tahiliani等(2009)Science 324(5929):930-035(2009)；Guo等(2011)Cell 145:423-434；Wu等(2011)GenesDevelopment25:679-684；Ko等(2010)Nature468:839-843；和Robertson等(2011)Biochem.Biophys.Res.Comm.411(1):40-3。还已知5hmC是稳定的DNA修饰，是由5mC通过10-11易位(TET)酶(例如TET1)催化氧化而形成的。

亚硫酸氢盐测序不能区分5mC和5hmC，因此，需要用于单独检测5mC和5hmC残基的其他方法。如上所述，5hmC的出现通常远低于5mC，因此，相对于所有经鉴定的5hmC残基的比例以及高选择性，用于检测5hmC的任何方法都需要表现出高效率，意味着基本上所有鉴定为5hmC的残基实际上应该是5hmC残基。已报道了数种用于检测DNA中5hmC的方法，这些方法涉及用T4噬菌体酶、β-葡萄糖基转移酶(β-GT)进行糖基化，因为该酶选择性修饰5hmC而不修饰5mC，如方案3所示：

方案3: