[发明专利]一种检测TSWV的速测卡及其制备、使用方法

说明书

本发明涉及一种免疫金标速测卡，应用双抗体夹心免疫层析的原理，检测植物样本中的番茄斑点枯萎病毒TSWV。检测时，首先向加样孔中加入待检样本，如果样本中含该病毒，在样本层析移动的过程中，病毒会与金标垫上的胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，然后被NC膜相应病毒检测线（T线）上的抗体沉积，相应病毒的检测线（T线）显色，多余的金标单克隆抗体在继续移动过程中被控制线上的二抗沉积，控制线（C线）显色；如果样本中不含上述病毒，则检测线（T线）不显色，控制线（C线）显色。应用该速测卡可现场对各种样品中TSWV进行准确、快速和灵敏的检测。

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的速测卡及其使用方法，具体是一种检测番茄斑点枯萎病毒（TSWV）的速测卡及其制备、使用方法。

背景技术

番茄斑点枯萎病毒（TSWV）为颗粒球状，直径70-99nm，外面有一层脂蛋白双膜。病毒很不稳定，体外存活期仅56小时，除花生外，该病毒还侵染番茄、烟草、马铃薯、茄子、辣椒、莴苣、菠萝等。

TSWV侵染引起花生芽枯病等植物病症，患病植株顶端叶片出现很多伴有坏死的褪绿环斑或黄斑，常沿叶柄或顶端表皮下的维管束变为褐色坏死或导致顶端枯死，顶端生长受抑，严重的节间短缩、叶片坏死，植株矮化明显。

目前常规检测TSWV的方法为PCR，需要专门的实验室场地，需要借助专门的仪器设备，并且对操作人员要求较高，需要有相当的专业知识、技能和操作经验，检测过程前处理复杂，所需时间很长。

以层析流动为检测原理的金标卡检测方法已在很多领域中有过应用，包括食品安全检测、植物转基因检测等，但针对烟草病毒的检测较少，而同时检测PVY和CMV等的速测卡还未见有公开报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种的速测卡及其制备、使用方法，并应用其针对叶片样品中TSWV进行快速、现场和灵敏的检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种检测番茄斑点枯萎病毒TSWV的速测卡，包含：底板上依次粘贴的样品垫、金标垫、NC膜以及吸收垫，所述的金标垫固定有胶体金标记的TSWV单克隆抗体，所述的NC膜有一条检测线，固定TSWV特异性多克隆抗体。

所述的TSWV单克隆抗体由分泌TSWV单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备得到。

所述的金标垫上单克隆抗体的量为5 ng-50 ng，优化的量为48ng；NC膜上多克隆抗体的量为0.4μg-1.2μg，优化的量为0.6μg。

分泌TSWV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO:C2019179。

还包括封盖板，所述的封盖板设置加样孔和结果观察孔，加样孔对应样品垫的位置，结果观察孔对应金标垫和NC膜位置。

所述的一种检测番茄斑点枯萎病毒TSWV的速测卡的制备方法，（1）将TSWV的特异性多克隆抗体和二抗分别固定于NC膜上；（2）在碱性条件下将胶体金颗粒与抗TSWV特异性单克隆抗体通过静电作用力相互结合；（3）速测卡的组装：底板上依次粘贴的样品垫、金标垫、NC膜以及吸收垫，加盖封盖板与底板合并形成速测卡。

所述的一种检测番茄斑点枯萎病毒TSWV的速测卡的使用方法，首先于加样孔中加入样品溶液并水平放置，1min后，于结果观察孔中观察颜色变化，作出判断；如果只有控制线C线，没有相应的检测线T线，则表明为待检物质为阴性；既有控制线C线，又有相应的检测线T线，则表明待检物质为阳性。