[发明专利]一种靶向序列捕获及PCR建库方法

说明书

本发明公开了一种靶向序列捕获及建库技术，本发明无需探针设计和链霉亲和素富集目标序列，只需要用普通引物，无需修饰。两步PCR即可同时对多样本进行靶向序列捕获与NGS文库制备，是一种比较经济、快速、准确的靶向序列捕获和建库技术。同时，本发明可有效地避免Overlap区域过度扩增，可检测未知的基因融合和罕见、低频突变位点检测，也适合于微量DNA的靶向序列捕获和NGS文库构建。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种靶向序列捕获及PCR建库方法。

背景技术

靶向序列捕获技术主要基于探针杂交捕获技术或者基于多重PCR两大类。

探针杂交捕获技术是指把特异性探针合成在固相或液相芯片上，从基因组文库中将靶基因序列捕获出来，主要产品如Nimble Gen Seq Cap Hybrid Capture(Roche)、SureSelect Hybrid Capture(Agilent)、TurSeq Capture(Illumina)和IDT Capture(IDT)为代表。

锚定多重PCR技术则以PCR为基础，在同一PCR反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个靶基因序列的PCR反应，主要产品如Halo Plex(Agilent)、AmpliSeq(Ion Torrent)、TruSeq Amplicon(Illumina)、Gene Read(Qiagen)、Clean Plex(Paragon)、Variant ProOne-step Capture PCR Technology(联川生物)、SLIM amp(Stem Loop InhibitionMediated Amplification，真固生物)为代表。

一方面，探针杂交捕获技术存在以下问题：1)对DNA起始量要求高，DNA量少时，会影响数据质量，甚至影响实验结果准确性，因此不适合稀有样本检测；2)探针合成需要生物素标记，后续实验还需要用昂贵的链霉亲和素磁珠进行靶序列富集，成本高，富集靶基因序列后仍需要post-PCR扩增；3)实验流程繁琐、费时费力、成本高；4)并且捕获新发的基因融合片段序列成功率不高，容易在洗涤过程中丢失；5)不能检测未知的基因融合变异。

另一方面，锚定多重PCR的捕获技术均存在缺陷。比如，部分多重PCR技术不能有效避免引物二聚体的形成与扩增，如Variant Pro、Ampliseq；部分多重PCR技术不能有效抑制非特异扩增，如CleanPlex(Paragon)；部分多重PCR技术不能有效避免连续基因序列扩增时引物Overlap区域的过度扩增，如CleanPlex(Paragon)；部分多重PCR技术在PCR时才添加UID分子标签，不能及时标记原始DNA模板，影响了超罕见、超低频基因突变的检测，如VariantPro、Ampliseq、SLIMamp等技术。而且多重PCR技术，需要对每个样本分别进行PCR扩增和建库，成本较高。

根据以上问题，研制新的一种靶向序列捕获及建库技术成为亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向序列捕获及建库方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明第一个方面，提出了一种多样本靶基因序列捕获及NGS文库构建方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：

1)根据需要捕获的靶基因区域设计特异性引物，特异性引物的5’端含有第一核酸序列；

2)使用转座酶复合物对基因组DNA、互补DNA进行片段化，所述转座酶复合物由第二核酸序列、转座酶识别序列与转座酶组成；

3)将上述片段化的DNA进行等量pooling，均一化样本捕获建库；

4)锚定多重PCR，对上述已经pooling的样本进行多重PCR，捕获和扩增靶基因序列；