[发明专利]一种猕猴桃溃疡病菌株变型快速鉴定方法

说明书

本发明公开了一种猕猴桃溃疡病菌株变型快速鉴定方法，涉及农业栽培技术领域，本发明通过采集菌株的DNA，并利用多对引物对对其进行M‑PCR扩增，然后根据扩增产物判断菌株的类型；若扩增产物包含311bp扩增子，则待测菌株为丁香假单胞菌猕猴桃致病种Psa，否则为丁香假单胞菌非猕猴桃致病种；扩增产物包含311bp扩增子同时包含254bp扩增子，则待测菌株为Psa日本/韩国变型；扩增产物包含311bp扩增子同时包含733bp扩增子，则待测菌株为Psa欧洲变型；扩增产物包含311bp扩增子同时包含609bp扩增子，则待测菌株为中国/新西兰变型；本发明能够快速实现猕猴桃溃疡病菌株的类型，简单高效。

技术领域

本发明涉及农业栽培技术领域，尤其涉及的是一种猕猴桃溃疡病菌株变型快速鉴定方法。

背景技术

猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞菌猕猴桃致病种(Pseudomonas syringaepv.actinidiae,Psa)引起，严重威胁世界猕猴桃生产。

根据菌株的遗传多样性和毒素的生产能力，国际上将不同地理来源的Psa分为5种不同的生物变型(Biovar1-6)。第一个变型Biovar 1分离自日本(1989年)和意大利(1992年)，这一类的菌株含有菜豆菌毒素(Phaseolotoxin)基因簇；第二个变型Biovar 2分离自韩国(1994年)，这一类菌株含有能产生冠菌素(Coronatine)的质粒；第三个变型Biovar 3来源广泛，意大利、新西兰、中国、西班牙、法国、葡萄牙、智利等主要猕猴桃生产国均有分布，这一类菌株毒力强、危害大；Biovar 4在新西兰、澳大利亚、法国少数果园出现，原本作为第四个变型，菌株毒力较小，仅引起猕猴桃叶片产生斑点，不会造成枝干溃疡，因此多数学者已经认同它不属于Psa；第四个变型Biovar 5菌株目前为止只存在于日本的部分地区(2012年)，该类菌株与Biovar 2亲缘关系较近，但既不产生冠菌素，也不产生菜豆毒素；最近，日本又发现了第五类变型Biovar 6，虽然它遗传上与Biovar 1最接近，但该类菌株既产生冠菌素又产生菜豆毒素(2016)。

目前，关于猕猴桃溃疡病菌株的鉴定研究较多，有采用病原菌的形态和生理生化特点等传统的鉴定方法，也有通过Rep-，IS50-和RAPD-PCR多种分子标记技术，还有应用16S-23S rDNA-ITS、毒素及Effector基因以及cts、gapA、gyrB、pfk、rpoD等管家基因序列分析，对Psa菌株类型(Biaovar1-6)进行区分和鉴定。

准确鉴定病菌的来源，对于了解病害发生、流行规律，进行针对性防控，具有十分重要意义。然而，目前现有猕猴桃溃疡病菌鉴定技术较为复杂，首先需要应用两对通用引物：ACT1/ACT2(Koh et al.2002)与PsaF1/R2(Rees-George et al.2010)，分别扩增出492bp与280bp的特异条带，以区分丁香假单胞菌猕猴桃致病种与其他致病种；再通过16S-23S rDNA-ITS、管家基因、或毒素及Effector基因克隆测序分析。虽然可以准确鉴定Psa的各种变型(Biaovar1-6)，但是耗时长、花费大，不能满足快速鉴别来源于不同国家区域菌株变型的需要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种猕猴桃溃疡病菌株变型快速鉴定方法,以解决现有技术中难以快速鉴定不同来源菌株的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种猕猴桃溃疡病菌株变型快速鉴定方法，该方法包括以下步骤：

步骤1、菌株DNA提取

获取待测菌株的DNA

步骤2、制备多对引物对

所述多对引物对具体为：

步骤2、M-PCR扩增