[发明专利]一种强化羟脯氨酸合成的质粒及其构建和应用

说明书

本发明涉及一种质粒，其包括抗生素抗性基因、表达脯氨酸‑4‑羟化酶的基因(P4H蛋白基因)、表达谷氨酸‑5‑激酶的基因(GK基因)以及表达γ‑谷氨酰磷酸还原酶的基因(GPR基因)构成的四基因多顺反子结构，该顺反子质粒上的LacI基因和LacO基因被去掉，构建出不需要诱导剂诱导的组成型表达外源基因的质粒。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及将一种重组质粒，以及转入该重组质粒构建的基因工程菌，以及使用该基因工程菌强化生产L-羟脯氨酸的方法。

背景技术

L-羟脯氨酸(L-Hydroxyproline，L-Hyp)为亚氨基酸——羟脯氨酸的一种同分异构体，全名为反式-4-羟基-L-脯氨酸(或L-羟基脯氨酸、L-羟脯氨酸)，是L-脯氨酸经羟基化之后的产物，其分子式为C₅H₉NO₃。L-羟脯氨酸呈白色片状结晶或结晶性粉末，微甜，熔点为274℃，易溶于水，微溶于乙醇。

L-羟脯氨酸是胶原蛋白的主要组成部分，不属于20种常见氨基酸，近些年来，L-羟脯氨酸的研究和开发已经引起医药、生化、食品及美容等产业的广泛关注。它可以作为化妆品添加剂，具有抗氧化、抗辐射的作用；它具有减肥作用，可望成为比较理想的减肥药物；它具有多种生理功能与独特的生物活性，既可以作为各种软组织疾病的药物，如结蹄组织受损、风湿性关节炎等，又可以加快伤口愈合，以及治疗各种皮肤病；它可以作为氨基酸注射液的重要成分，它对急慢性肝病所导致的低蛋白血症有一定的疗效；它参与脂肪的乳化及红细胞血红素和球蛋白的形成，具有调节脂肪乳化等作用；它还是多种药物，如第三代抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等的合成原料。

目前，生产L-羟脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、酶转化法和微生物发酵法，其中蛋白水解提取法和化学合成法因环境污染等原因，已逐步被酶转化法和微生物发酵法取代。

酶转化法以L-脯氨酸和α-酮戊二酸为原料，利用高表达L-脯氨酸羟化酶的重组菌株作为酶源，经酶转化反应得到L-羟脯氨酸(Hyp)。

微生物发酵法利用谷氨酸激酶(GK)、谷氨酰磷酸还原酶(GPR)、脯氨酸4-羟化酶基因(P4H)共表达的重组菌株，以甘油或葡萄糖糖为原料产生Hyp，与以脯氨酸为底物的酶转化法相比，更具成本优势。

大肠杆菌因具有遗传背景清楚、载体受体系统完备、生长迅速、培养简单、重组子稳定等优点，特别适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达等方面，常常被用来作为外源基因表达的宿主菌。

然而，目前普遍采用的大肠杆菌重组菌，存在菌株不稳定、发酵水平低、需要使用诱导剂IPTG或乳糖诱导等问题。

IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂不会被重组大肠杆菌代谢而十分稳定。IPTG存在的情况下，其可与阻遏物结合形成复合物，引起阻遏物变构，不能再Lac O基因结合，从而促进基因的表达。但是由于IPTG化合物本身具有一定的毒性，当利用IPTG诱导表达时，发酵液中残留的IPTG难以在最终的产品中完全去除。同时IPTG价格较为昂贵，在较大体积的发酵罐中进行诱导时，会造成发酵成本的增加。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足，本发明提供了一种强化表达三个基因以及适当的抗生素抗性基因的人工构建的质粒，该质粒上的LacI基因和LacO基因被去掉，构建出不需要诱导剂诱导的组成型表达外源基因的质粒；将该质粒转入大肠杆菌中形成基因工程菌；利用该基因工程菌在发酵中强化合成L-羟脯氨酸途径，以提高L-羟脯氨酸的产量。

本发明具体涉及如下内容：

1.一种质粒，其包括抗生素抗性基因、表达脯氨酸-4-羟化酶的基因(P4H蛋白基因)、表达谷氨酸-5-激酶的基因(GK基因)以及表达γ-谷氨酰磷酸还原酶的基因(GPR基因)。