[发明专利]一种强化羟脯氨酸合成的质粒及其构建和应用

权利要求书

1.一种质粒，其包括抗生素抗性基因、表达脯氨酸-4-羟化酶的基因(P4H蛋白基因)、表达谷氨酸-5-激酶的基因(GK基因)以及表达γ-谷氨酰磷酸还原酶的基因(GPR基因)；

其中，与脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)和γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)相比，所述抗生素抗性基因设置在3’端；

所述质粒为组成型质粒，还包括Trc启动子基因(Trc)，与脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)和抗生素抗性基因相比，Trc启动子基因(Trc)设置在5’端；

其中，设置在抗生素抗性基因之前的基因的终止子被敲除，脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、抗生素抗性基因构成共同以Trc启动子启动的四基因多顺反子结构；

其中，所述抗生素抗性基因是四环素抗性基因(TetR)。

2. 根据权利要求1所述的质粒，其中，该质粒从5’端到3’端依次包括：

Trc启动子基因(Trc)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)以及抗生素抗性基因；或者

Trc启动子基因(Trc)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)以及抗生素抗性基因；或者

Trc启动子基因(Trc)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)以及抗生素抗性基因；或者

Trc启动子基因(Trc)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H) 、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)以及抗生素抗性基因；或者

Trc启动子基因(Trc)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)以及抗生素抗性基因；或者

Trc启动子基因(Trc)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、以及抗生素抗性基因；

所述抗生素抗性基因是四环素抗性基因(TetR)。

3.一种构建如权利要求1或2所述的质粒的方法，其包括如下步骤：

构建分别表达脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H基因)、谷氨酸-5-激酶基因(GK基因)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR基因)三个基因的原始质粒，所述三个基因位于Trc启动子之后；

对原始质粒进行抗性替换，使之在上述三个基因下游的位置携带抗生素抗性基因，所述下游为靠近质粒基因组3’的一端；

将抗生素抗性基因的启动子及其上游紧邻的基因的终止子敲除，形成表达稳定型质粒，所述上游为靠近质粒基因组5’的一端；以及

将Trc启动子前后紧邻的LacI和LacO基因敲除，形成组成型质粒。

4.一种基因工程菌，其携带权利要求1或2所述的质粒。

5.一种制造L-羟脯氨酸的方法，其包括：

使用如权利要求4所述的基因工程菌进行需氧发酵的步骤，其中在所述发酵中不使用诱导剂。