[发明专利]一种结合内标对样本中真菌进行绝对定量的方法

说明书

本发明公开了一种结合内标对样本中真菌进行绝对定量的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种结合内标对样本中真菌进行绝对定量的方法，此方法为先将一定浓度的重组质粒加入大曲、酒醅等待测样本中作为内标质粒，然后以重组质粒的浓度为依据，直接计算得到各真菌在待测样本中的浓度，避免了微生物计数的步骤，操作更为简便。

技术领域

本发明涉及一种结合内标对样本中真菌进行绝对定量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

中国白酒的历史源远流长，至今已有千年的历史。现在，白酒已经同茶叶、美食一起成为中国传统文化的一部分，“无酒不成席”、“朋友来了有好酒”也已成为中国人礼仪的一部分。作为一种文化传承，我国白酒产业必须走健康可持续的发展道路。

目前，中国大部分名优白酒都使用传统的大曲法酿造。大曲是以大麦、小麦、豌豆等为原料，经过破碎、加水拌料、压成砖块状的曲醅后，在人工控制的温度、湿度下培养而成的。大曲中含有丰富的霉菌、酵母、细菌等微生物及它们产生的各种酶，是一种多菌种的混合粗酶制剂，其中，真菌的作用不容忽视。由于大曲中栖息着丰富的微生物，加曲不但使大量有益的酿酒微生物菌种直接转移到发酵酒醅，而且还给酒醅提供了以淀粉酶、蛋白酶为主的各种酶类，同时，大曲还给酒醅带来了数量可观的、多种多样的代谢产物，在赋予大曲酒更好的口味和香气方面起着重要作用。

微生物的绝对数量已被证明是全面分析自然环境中微生物群落所必不可少的。中国白酒是我国优秀的文化结晶，解析白酒酿造过程中微生物，对中国白酒的发展有着不可估量贡献。大曲微生物中真菌的绝对定量将更利于研究白酒酿造过程中微生物多样性，并进一步对白酒风味物质及其产生机理进行深入研究。这使得从根本上揭示白酒微生物多样性及风味物质之间的关系和规律成为可能，此关系和规律可指导白酒酿造工艺设计，对进一步提高白酒的品质、和改善白酒的风味至关重要。

目前，大曲中微生物的解析主要依赖高通量测序进行分析。然而，受技术限制，高通量测序结果中只有微生物分类及其相对丰度，不同分类水平微生物的绝对含量却不能获得。当样本间微生物总量变化较大时，以相对丰度表征不同样本间的微生物数量差异，可能会带来误差，甚至是相反的结论。

杨黎设计含有三域(真菌、细菌、古菌)的序列克隆到质粒中导入菌株，以此作为内标菌株加入土壤，通用高通量测序进行土壤中微生物的定量。但是，此方法直接以菌株作为内标，而加入土壤的菌株无法实现准确的定量，会造成极大的误差，准确性低。并且，三域内标菌株中的16S及ITS基因片段大小与土壤微生物的平均16S及ITS基因片段大小差异较大，而有研究表明，在高通量测序技术的微乳液PCR中，同一对引物对长度较短的片段的扩增具有一定偏好性，从而影响了长片段的扩增效率，造成准确性低下(具体可见参考文献：杨黎.土壤微生物群落高通量绝对定量方法建立及其应用[D].浙江大学,2018.)。

因此，急需找到一种准确度更高的对大曲中真菌进行绝对定量的方法，以揭示白酒微生物多样性及风味物质之间的关系和规律，进而指导白酒酿造工艺设计，为进一步提高白酒的品质、和改善白酒的风味打下基础。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种准确度高的对样品中真菌进行绝对定量的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种结合内标对样本中真菌进行绝对定量的方法，所述方法为先将重组质粒作为内标添加至待测样本中，使得待测样本中重组质粒的浓度为1×10⁶～1×10¹¹copies/g，得到混合物，然后提取混合物的基因组DNA，以核苷酸序列如SEQID NO.1所示的DNA片段作为上游引物、以核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的DNA片段作为下游引物对混合物进行高通量测序，得到混合物中重组质粒数量和各真菌数量占混合物中质粒与真菌总数量的比例，最后根据重组质粒在待测样本中的浓度利用公式计算得到各真菌在待测样本中的浓度，其中，公式如下：