[发明专利]产L-谷氨酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种产L‑谷氨酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明首先公开了重组大肠杆菌，其与作为出发菌的大肠杆菌相比，谷氨酰胺合成酶的基因的表达量和/或含量和/或活性增加，和/或下述蛋白质的基因的表达量和/或含量和/或活性降低；所述蛋白质为如下至少一种：谷氨酰胺酶A；谷氨酰胺酶B；同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性的双功能酶；肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶；PII‑1蛋白。进一步提供了制备L‑谷氨酰胺的方法。本发明通过在大肠杆菌中过表达谷氨酰胺合成酶的基因，同时阻断旁路途径，开发了一套以L‑谷氨酸为底物高效合成游离L‑谷氨酰胺的方法。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种产L-谷氨酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-谷氨酰胺(L-glutamine，L-Gln)，别名左旋谷氨酰胺，学名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，是谷氨酸的酰胺。谷氨酰胺于1914年首次在人体中被发现，是人体内丰度最高的非必需氨基酸，血液中的浓度可高达0.4～0.9mM。谷氨酰胺主要由骨骼肌合成、储存和释放，少部分在脂肪细胞、肝和肺合成；可被肠细胞、肾、肝、胰岛细胞和免疫细胞吸收。由于谷氨酰胺合成能力大大超过了蛋白质中的谷氨酰胺含量，并且存在于细胞质中，因此，谷氨酰胺主要由从头合成获得。在运动等生理应激过程中，血液中皮质醇浓度的增加可引起肌肉蛋白质的水解，氨基酸转氨为谷氨酸，谷氨酰胺合成和释放增加。每天大约有8-9克谷氨酰胺从整个人类肌肉组织中释放出来。

谷氨酰胺被认为是一种“条件必需氨基酸”，在所有氨基酸中具有最丰富的功能，在维持肠道功能，促进免疫机能，维持内环境稳态以及提高机体对应激的适应性等方面都发挥着极其重要的作用，对人类健康具有重要意义。

健康状态下，通过食物获取、骨骼肌和肝脏内源合成维持充足的谷氨酰胺储量；而当人体处于疾病或应激压力时，谷氨酰胺的需求量会大大增加而失衡，导致人体出现代谢紊乱和临床症状。

目前生产L-谷氨酰胺的方法主要为：1)化学合成谷氨酰胺：主要以谷氨酸和甲醇为原料，该过程主要经过酷化、氨解、酸解和结晶等过程。该方法相对复杂，成本较高，并且在制取过程中使用的化学试剂残留会使产品带有一定的异味，使该工艺的发展受到了严重制约，其产品的应用范围也受到了影响。2)发酵法生产谷氨酰胺是谷氨酰胺生产中采用的最普遍的方法。由于发酵生产中的原料来源广泛以及对生产菌的不断剔选和改造，发酵法生产谷氧酰胺取得了更加显著地成就。但发酵法效价仍有待进一步提高，发酵液成分复杂，分离纯化步骤较为复杂，因谷氨酰胺在常温下易分解，因而只能在低温下进行，更进一步增加了谷氨酰胺精制的成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供L-谷氨酰胺高产菌株，以实现发酵法高效大规模工业化生产 L-谷氨酰胺。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组大肠杆菌。

本发明所述重组大肠杆菌与受体大肠杆菌相比，所述重组大肠杆菌中下述蛋白质的基因的表达量降低和/或所述蛋白质的含量降低和/或所述蛋白质的活性降低；

所述蛋白质选自如下至少一种：

1)谷氨酰胺酶A(GlsA)；

2)谷氨酰胺酶B(GlsB)；

3)同时具备谷氨酰胺合成酶腺嘌呤转移酶活性(ATase)和谷氨酰胺合成酶去腺苷化活性(ATd) 的双功能酶(GlnE)；

4)肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶(LpxM)；

5)PII-1蛋白(GlnB)。

上述重组大肠杆菌中，所述重组大肠杆菌与受体大肠杆菌相比，所述重组大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶的基因的表达量增加和/或所述谷氨酰胺合成酶的含量增加和/或所述谷氨酰胺合成酶的活性增加。